十足目虹彩病毒1檢測 熒光定量PCR法

1十足目虹彩病毒1檢測熒光定量PCR法本文件描述了十足目虹彩病毒1熒光定量PCR檢測法的試劑與材料、儀器設(shè)備、操作方法及結(jié)果判定。本文件適用于十足目虹彩病毒1的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3試劑與材料3.1一般要求本文件所用試劑如無特殊說明均為分析純試劑；試驗用水應(yīng)符合GB/T6682一級水的要求。3.2引物與TaqMan-MGB探針上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1、TaqMan-MGB探針DIV1-qP1根據(jù)表1給出的寡核苷酸序列人工合成，擴(kuò)增167bp的目的片段。使用濃度均為10μmol/L。使用前按本標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌DEPC水稀釋，稀釋后分裝成小量置于-20℃保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。表1特異性引物及探針寡核苷酸序列及擴(kuò)增的目的片段大小FAM-CCATAGGCACCGCAA3.3DNA抽提試劑3.3.1商品化DNA抽提試劑盒。3.3.2異丙醇。3.3.3無水乙醇。3.3.4熒光定量PCR試劑。3.3.52×PremixExTaq?(ProbeqPCR)。3.3.6ROXReferenceDye或ROXReferenceDyeⅡ：參考儀器使用說明，用以校正孔間熒光信號誤差。3.3.7工作標(biāo)準(zhǔn)品為pMD18-T-MCPDIV1：可委托生物公司制備，使用濃度為1.0×104拷貝/μL～1.0×107拷貝/μL。3.3.8陽性對照為已知DIV1陽性的對蝦組織，-80℃保存。3.3.9陰性對照為已知DIV1陰性的對蝦組織，-80℃保存。3.3.10空白對照以無菌雙蒸水為模板。24儀器設(shè)備及耗材4.1儀器設(shè)備4.1.1定量PCR儀。4.1.2高壓滅菌鍋。4.1.3組織勻漿機(jī)。4.1.4普通冰箱：具冷藏箱，可達(dá)到-18℃以下冷凍箱體。4.1.5超低溫冷藏設(shè)備：可達(dá)到-80℃。4.1.6水浴鍋或金屬浴。4.1.7臺式高速離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速能達(dá)12000r/min以上。4.1.8旋渦振蕩器。4.1.9微量離心機(jī)。4.1.10微量移液器。4.2耗材4.2.1微量移液器槍頭。4.2.21.5mL微量離心管：經(jīng)高壓蒸汽滅菌，一次性使用。4.2.3滅菌0.2mLPCR管：經(jīng)高壓蒸汽滅菌，一次性使用。4.2.4塑料或乳膠手套：一次性使用。5操作方法5.1采樣樣品采集按SC/T7103的規(guī)定執(zhí)行。5.2樣品前處理蝦樣按不同規(guī)格取不同組織。其中，受精卵、幼體、仔蝦采集整條蝦作為樣品，3cm以下幼蝦采集除蝦眼外整條蝦作為樣品，3cm以上蝦采集鰓、肝胰腺作為樣品。采集的樣品用組織勻漿機(jī)勻漿，立即進(jìn)行DNA提取操作或-80℃超低溫冰箱保存。5.3陽性對照樣品和陰性對照樣品的處理陽性對照樣品和陰性對照樣品的采集和取樣分別按6.1和6.2進(jìn)行，將采集的蝦組織樣品勻漿后小量（30mg）分裝于1.5mL離心管后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。每次檢測前各取出1管陽性對照和陰性對照樣品，與待檢樣品進(jìn)行下面的操作。5.4DNA的提取取5.2中30mg樣品，按照商品化動物組織基因組DNA快速提取試劑盒說明書提取總DNA，最后加60μL洗脫緩沖液溶解DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5熒光定量PCR采用50μL反應(yīng)體系。在熒光定量PCR管中依次加入滅菌DEPC水13.5μL，2×PremixExTaq?(ProbeqPCR)25μL，ROXReferenceDyeⅡ0.5μL，上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1、探針DIV1-qP1各2μL，模板5μL。加完試劑后瞬時離心，將PCR反應(yīng)管置于定量PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，按下面反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火并延伸45s，擴(kuò)增40個循環(huán)；在60℃結(jié)束時收集熒光信號。6結(jié)果判定6.1定性檢測陽性對照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性對照和空白對照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實驗有效；若檢測樣品的Ct值小于或等于35，且有擴(kuò)增曲線，則判為DIV1DNA陽性；Ct值大于35，且有擴(kuò)3增曲線，則重復(fù)1次，如結(jié)果一致，判為DIV1DNA陽性；Ct值大于35，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為DIV1DNA陰性。6.2定量檢測6.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)小于或等于-0.970，陽性對照Ct值小于35且出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，陰性對照和空白對照Ct值不顯示且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，實驗有效。6.2.2檢測樣本中1×103拷貝/mg≤DIV1DNA≤1×108拷貝/mg，測定結(jié)果有效，可直接報告陽性及相應(yīng)的拷貝量。6.2.3檢測樣本中DIV1DNA＞1×108拷貝/mg，即可直接報告為＞1×108拷貝/mg，也可用滅菌DEPC水10倍梯度做相應(yīng)稀釋，使其拷貝量落在1×105拷貝/mg～1×107拷貝/mg范圍內(nèi)再重新測定，測定結(jié)果應(yīng)以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正。6.2.4檢測樣本DIV1DNA的拷貝量為10拷貝/mg～1×103拷貝/mg時，建議對該樣本進(jìn)行雙份重試，如雙份樣本重試結(jié)果仍在10拷貝/mg～1×103拷貝/mg，則按實際值計算；如雙份或一份重試結(jié)果＜10拷貝/mg，則判為DIV1DNA陰性。6.2.5Ct值不顯示時或DIV1DNA的拷貝量＜10拷貝/mg，該樣本判為DIV1DNA為陰性。4（規(guī)范性）DIV1熒光定量PCR特異性引物及探針序列和檢測結(jié)果圖示A.1DIV1MCP基因序列及特異性引物和探針圖示ATGTTGAGATTTATTTATGAAAAAAAAATCTTGTTAATAAAAAATTGTAAAATGGCTAATATTGCAGGAGCTCTACAAGATATGGCTAATCTAGGGGCGGTTGAAAGGTACCAGTACGGAACCACCAACGCCGTCACTTATTTTATTCGTGAAACGAGAAAGTCTACATTGTTTTCTCAACTCCCAATTCAACTCTCATCTAAAAATGGAAATCCCGATTTCGATCGTGAATGGTCTGTAGAACCAAGTAAGGCGTTCGATTATCTGATCCATATGTGGATCCGGGTTACCGTTCCCGAAGTTAAACTTTTGGCGGGTAATGTATATAAGGAGCACGGTCGAATTCGCTGGACCCGAAACTTTATGCACAATCTTATCAAGAAGGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCGAGATTGAAAAGTTTGACAACTATTTCCTCGATTTCTGGAACCAATTTACTCTGTCCTCTTCAAAGAAGGATGGATACAACAACATGATTGGAAACGATGATGATCTTCTGATCCCAAAATCCAAGGATGGAAAGATTGAATCAAAGAGTCTTACACTTCCTATCCCCTTCTTCTTTTCTCGTGATTCTGGTTTGGCTCTCCCAGTCGGTGGTGTCAAGTGGAACAAGCTCAGGATTGATTTCGAATTCAGGAACTGGACAGAGCTTCTGATTCTTGAAAATGTTGGTGCGGCCCACAATGGAGAGAAAAATCCATGCAAGGTTCCTCAGGTTGGAAGTGATATCGCCGTTGCCCCCTCACTGTCAAATGTGCAATGTTGGGTGAATGGTGGTCTTATCCCCGAAGCCGAGCGAGCACGTATGGGATGTGTTCACCGCGACATGTTGATTGAATCTATCCAGACTTCTTCCAAGCTCAACTTTAACCCCGTCCTCAACCCAAATCCCTCTTACGACATCAGGTTCCAGAGAACTGTAAAGGCTCTCTTCTTCGGTGTCAGGAACACTACCAATCCAAATGTTTGGTCCAATTACACAACCGCATCACCCGTACCCGACGCCGACAAGATTGATTTCGACCCAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGCAAACATTAGATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGATGACTGCCGATTACTTCTCACTGATCGAACCCTACTACAAGGCACCGGCCATTCCCGAACTCACCGGATACCACATGTTCTCTTACGCTCTCAAGATGAACAATGTTGATCCTTCTGGGTCTGCCAATTACAGCATCCTGAACAATGTGAGTATCCAACTTCAATGCTCCGAAGCTGCTATTAAAGCGGCAAAG