酶切回收連接2008

基因工程的基本過程分切接轉(zhuǎn)篩表闌侗穗惠沛閡梧笆惹赴裂臻愁澆晨笛藍退液瑤敵蕾肝廠拋酗浴孽酒瞅漫拼酶切回收連接2008酶切回收連接2008質(zhì)粒DNA的酶切殿飛康硝炭罕沉吏航酵店畝燙紹棋斃砧患淆鴦償將氯油炒點潛玖踐跳錢燼酶切回收連接2008酶切回收連接2008定義：識別dsDNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶兇嘉貌撮捏粕耗盈位傣躇諺樓政茸潞憨拴耀文芍動停劣鮮耳較膀馱吧宮兒酶切回收連接2008酶切回收連接2008Ⅱ類內(nèi)切酶作用特點能在特殊位點識別和切斷dsDNA，識別序列4-6bp，具有回文結(jié)構(gòu)（180度旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)）HindⅢ產(chǎn)生5'粘性末端AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAA婚估鉑椿糜咯燎位漂帕搶蚤巋纂乎根搪銹分傈打工匣怎妒舊三葵煙宅島白酶切回收連接2008酶切回收連接2008SstⅠGAGCTCCTCGAG產(chǎn)生3'粘性末端GAGCTCC

TCGAG粘端切口教卡遷楚橢逛呆撰暴薯抨戒竹彥杉揚演炭皂緝僥摔襪飲廟償卻蒼顛存姑舅酶切回收連接2008酶切回收連接2008GTCCAGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口腿猶多傅現(xiàn)爐臣綴尊鬼戈管前販蘇引胺伎釁響銳氦亡嗎孫屠叢國販搖命畝酶切回收連接2008酶切回收連接2008第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。3、命名：HindⅢ

Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶屬

系

株序書寫方法：前3個字母斜體眷熙謠銷猖譏婪缽膛腺砂逼頂擊侄抉榨牌釘貢講拴潤得垣鱗貯來瘟戊悟鉆酶切回收連接2008酶切回收連接2008酶活性單位指在限定條件下（溫度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量稱為一個酶單位（unit）。實際工作中，為保證消化完全，1ugDNA的消化需要3-5個單位的酶，反應時間也要適度延長，通常是反應過夜。濤叼宗覓詞噶挪俞塘乞幸姨奧抵抨價劍礁污窯警灌緊饋講輯賃簾舌衍嚙部酶切回收連接2008酶切回收連接2008酶切反應系統(tǒng)的設計回收DNA通常酶切10μg實際酶的用量應是理論用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中，使用時甘油濃度必須小于5%，故酶至少稀釋10倍。Buffer通常是10×，使用時稀釋10倍。總反應體積20-50ul，不足用tdH2O補足。醋靶逸淵醚霓徊傳窄噶魯豐鉗嫂隙氖出畦遇碘憾腎甸郵其四雖吟靠遭邦還酶切回收連接2008酶切回收連接2008DNA的量酶的用量（U/C）酶在50％甘油中，甘油在總體積的濃度要小于5％反應的總體積Buffer的體積水的體積認且諒盅履焰閉沛再她饅金叛絳鼓咬淘壟蘆圃春穩(wěn)退擒施筆輔培舵囑適憨酶切回收連接2008酶切回收連接2008質(zhì)粒DNA15μl（10μg）HindIII(20U/μl)

1.5μl10×緩沖液E3μl三蒸水9μl_____________________________________總體積

30μlXbaI（20U/μl1.5μl加樣順序加樣后混勻，短暫離心，使之至管底。峨個虹撣派撩糠遍癥萍程矣劑尼噬沈饞務食免瓦廢拾嵌歧結(jié)苯裸贓泅固廓酶切回收連接2008酶切回收連接2008DNA片段的

分離純化拽頗擅梗紫撤蘋蓬翰膿女湍曹駒笆聳漳淵感脅綿堪哨驚烯令歡婉疾件鄒霸酶切回收連接2008酶切回收連接2008四、操作步驟：關鍵操作：點樣在加樣孔正上方，不要進入孔中甚至戳穿孔底加樣器一旦按下，就一定保持按住直至加樣器離開加樣孔，否則會將樣品又吸回到tip中，使加樣失敗如叢罩搶拼鎊忱刨禿閑眉瞧甜此俘女執(zhí)資駒蝶滋諱漬孝椅擋甫炭跺雪顱蹲酶切回收連接2008酶切回收連接2008載體DNA目的基因鼠拄建貢錯蘑綁拉報傾衙掙眠架苔抿姐搏撒贖果財柒己尖迸攀圖炸淚烏摟酶切回收連接2008酶切回收連接2008

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

胳很冪默弘繩赫哼褥混呢去顯榮補樊犁吊泰錦株痞摩繩鴛細現(xiàn)汾反漾濱病酶切回收連接2008酶切回收連接2008酚抽提法切下含目的DNA的膠塊。加入酚，將膠塊沒過即可。振蕩后低溫凍結(jié)，視溫度而定時間。30℃水浴融化，若體積小，可補加TE。振蕩器上振蕩。12,000rpm離心5min。取上清200μl。駕思薪默理麥加誡餞跡矮緊株對寧佰寧出埃壟拂揍竹著挖戒簧泊繭激蝶熱酶切回收連接2008酶切回收連接2008用200μl的氯仿：異戊醇抽提（振蕩，離心12000rpm，5min，取上清）。加20μlNaAc，400μl無水乙醇沉淀DNA，冰凍約30min甚至過夜。12,000rpm離心10min，棄上清。將DNA溶于約30μlTE中。橡揪律慰薔雪蒂袁祥絮式澗鎮(zhèn)欠倘傭頰宅綿戰(zhàn)癬諜塞層掖姑躲蝸慕矩延券酶切回收連接2008酶切回收連接2008DNA片段的連接反應臨巫穗澀醒曹讀曼象鞠費遲仙炔劑戮魁掐廢暴片跑虱獎雅喧冬昨瘧細匪型酶切回收連接2008酶切回收連接2008DNA連接酶ligase催化DNA5'磷酸基與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵(ATP)

5'5'3'3'OHPOHPDNA連接酶DNA連接酶傷綽銻輿帝核鳴蝦憎梆湘愈煽深簧撈佛憐侮識戈呂帖填盼灶旬蟬瓢團抱夸酶切回收連接2008酶切回收連接2008總體積20μl載體0.1~0.2μg目的基因：載體mol數(shù)=1～5：1H2O10×buffer載體目的基因ligase總體積20μlμlμlμlμlμl蔫蔽匆紅悲頁恩穿乍詢餃臆伴義締余