綿羊進(jìn)行性肺炎抗體檢測方法 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

綿羊進(jìn)行性肺炎抗體檢測方法瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了綿羊進(jìn)行性肺炎(梅違-維斯納病)抗體檢測的操作方法和步驟。本標(biāo)準(zhǔn)用于檢測綿羊進(jìn)行性肺炎(梅迪維斯納病)病毒抗體，適用于本病的檢疫、診斷，疫情監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，形成凝膠后呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑的大小取決于瓊脂濃度。抗原和抗體的分子量一般都在20萬以下，抗原及其特異性抗體在凝膠中從高濃度區(qū)域向低濃度區(qū)域擴(kuò)散時(shí)受阻力很小，基本上呈自由擴(kuò)散形式。由于不同抗原分子的分子量、結(jié)構(gòu)、形狀和電荷量不同，因此其擴(kuò)散系數(shù)不同，在凝膠中的擴(kuò)散速度也就不同。當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴(kuò)散后在凝膠中相遇，形成抗原抗體復(fù)合物。若兩者在相遇處比例適當(dāng)，則形成最大的復(fù)合物。由于復(fù)合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀，呈現(xiàn)出線狀或帶狀的“特異性屏障”,稱為免疫沉淀線或免疫沉淀帶，因此，可根據(jù)抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間出現(xiàn)的這種沉淀線或沉淀帶和抗原與被檢血清之間是否出現(xiàn)沉淀線或沉淀帶來判定被檢血清中是否存在抗體。MV/OPP病毒最重要的抗原有兩種，一種是病毒的囊膜糖蛋白，通常稱為gP135;另一種為核心蛋白P28,制備這兩種蛋白時(shí)收取感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，經(jīng)聚乙二醇透析濃縮50倍左右后獲得的一種抗原制劑。以此抗原檢測MV/OPP病毒抗體，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。從理論上講，這兩種抗原蛋白與其相應(yīng)的陽性血清虛該成兩條沉淀線，但試驗(yàn)結(jié)果證明，幾乎所有的被檢陽性血清只形成一條明顯的沉淀線。3材料準(zhǔn)備3.2MV/OPP瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：由OIE參考實(shí)驗(yàn)室或國家有關(guān)部門指定生產(chǎn)廠家或指定實(shí)驗(yàn)室提供，按說明書使用。3.3被檢綿羊血清：按常規(guī)方法采血，分離血清，56℃水浴滅能30min。血清應(yīng)無溶血、無細(xì)菌污染，保存于4℃。3.4器材；天平、吸管、量筒、平皿(規(guī)格為90.0mm×15.0am)、三角瓶、外徑為5.3mm的七孔梅花樣金屬打孔器、微量移液器和微量吸頭、觀察燈、水浴鋼、高壓滅南錫等。4操作方法和步驟4.11%瓊脂板的制備。4.1.1TrisHCl緩沖液的配制；見附錄A。4,1.21%瓊脂的制備：取TrisHCl緩沖液100mL加入瓊脂糖1.00g,氯化鈉8.50g,加熱充分溶解，加0.01%疊氮鈉，分裝入試管，每管16mL備用。4.1.3制板：將試管內(nèi)瓊脂加熱融化，待瓊脂溶液自然冷卻至約56℃時(shí)，將直徑為90mm潔凈滅菌的平血置于平臺(tái)上，每個(gè)平皿加瓊脂溶液16mL,使凝膠厚度達(dá)2.8mm。加蓋待自然冷卻凝固，把平皿倒2置濕盒中，4℃冰箱密封備用。4.1.4打孔：反應(yīng)孔現(xiàn)用現(xiàn)打。從冰箱中取出瓊脂板，立即按7孔一組(見圖1)的梅花圓形打孔(中間1孔，周圍6孔),或按25孔一組(見圖2)的矩形打孔(中間行9孔，上下2行各為8孔),孔徑5.0mm,孔距3.0mm,將孔中的瓊脂輕輕挑出或吸出，勿傷邊緣及使瓊脂層脫離玻片，以免滲漏，可將打孔后瓊脂板底部經(jīng)酒精燈火焰上方快速來回5次～7次加熱封底。制好孔型的平皿寫上日期及編號。++4.2加樣：使用圖1時(shí)，用微量移液器吸取抗原懸液滴入中間孔；使用圖2時(shí)，G孔加抗原。+孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其他標(biāo)有1、2、3……數(shù)字的孔分別加入被檢血清，每孔加35pL～50pL,每孔均加滿不溢出為度。每加一個(gè)樣品應(yīng)換一個(gè)滴頭。4.3反應(yīng)：加樣完畢后，靜止10min,將平皿例置，放入濕盒于室溫(22℃~25℃)中孵育，24h初判，48h終判。5結(jié)果判定5.1判定方法將瓊脂板置暗視野下觀察，抗原孔與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔之間出現(xiàn)一條清晰致密的白色沉淀線，則試驗(yàn)可以成立，否則視為無效，要更換試劑做重復(fù)試驗(yàn)。5.2判定標(biāo)準(zhǔn)5.2.1若抗原孔與被檢血清孔間出現(xiàn)清晰致密沉淀線，并與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀線末端相連接，位置微向內(nèi)側(cè)彎曲時(shí)，則被檢血清判為陽性(見圖3)。5.2.2若抗原孔與被檢血清孔間雖不出現(xiàn)沉淀線，但抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔間的沉淀線在被檢血清孔位置微向內(nèi)側(cè)彎曲者，則被檢血清判為疑似反應(yīng)。對該份血清應(yīng)復(fù)檢，仍為疑似則判為陽性反應(yīng)(見5.2.3若抗原孔與被檢血清孔之間不出現(xiàn)任何沉淀線，且抗原孔與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔間沉淀線直向被檢血清孔或向其外側(cè)偏彎者，則被檢血清判為陰性(見圖5)。5.2.4若抗原孔、被檢血清孔之間的沉淀線與抗原孔、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔之間的沉淀線交又，則判為非特異性反應(yīng)，應(yīng)重做。若仍出現(xiàn)非特異性反應(yīng)則判為陰性(見圖6)。6注意事項(xiàng)6.1加樣時(shí)將孔加滿為宜，切忌樣品濫出。若溢出樣品流入鄰近孔時(shí)應(yīng)重做。6.2所有樣品加樣完畢后，樣品應(yīng)暫放4℃冰箱內(nèi)保存，待判定結(jié)果后如無復(fù)檢必要時(shí)再廢棄。6.3標(biāo)準(zhǔn)陽性血清避免反復(fù)凍融，以免降低效價(jià)影響檢出效果。(規(guī)范性附錄)Tris-HCI(三羥甲基胺基甲烷-鹽酸)緩沖液的配制去離