禽白血病病毒p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法

1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽白血病病毒(ALV)p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)雞蛋蛋清以及雞胚組織細(xì)胞培養(yǎng)物中的ALVp27蛋白抗原。2p27抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)2.1試驗(yàn)材料2.1.1.1抗p27蛋白抗體：應(yīng)用提純的禽成髓細(xì)胞性白血病病毒p27蛋白免疫家兔制備。2.1.1.2陽(yáng)性抗原：含雞白血病/肉瘤病毒群特異性p27蛋白抗原的雞蛋清。2.1.1.3陰性抗原：無(wú)雞白血病/肉瘤病毒群特異性p27蛋白抗原的SPF雞蛋清。2.1.1.4酶結(jié)合物：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗p27蛋白抗體。2.1.1.5磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見(jiàn)第A.1章。2.1.1.8樣品稀釋液：配制見(jiàn)第A.4章。a)酶聯(lián)檢測(cè)儀；b)聚苯乙烯板；d)37℃恒溫培養(yǎng)箱。2.1.3.1雞蛋樣品：將待檢雞蛋小的一端朝上放置，打碎蛋殼，用移液器無(wú)菌吸取蛋清，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)。2.1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)物：用移液器無(wú)菌吸取細(xì)胞培養(yǎng)物，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)，4℃或-30℃保存或立即送檢。試驗(yàn)前將送檢樣品統(tǒng)一編號(hào)，試驗(yàn)時(shí)不做稀釋。2.2操作方法2.2.1用包被液將抗p27蛋白抗體作4000倍稀釋，每孔100μL加入96孔聚苯乙烯板中，4℃過(guò)夜。2.2.2取出包被好的聚苯乙烯板，將液體倒棄，每孔加250μL洗滌液漂洗三次，每次2min,甩干。2.2.3每孔加150μL質(zhì)量濃度為1%的明膠封閉液，37℃反應(yīng)60min。2.2.4重復(fù)2.2.2。2.2.5在A?、A?孔各加100μL標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照，A?、A?孔各加100μL標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照。2.2.6將待檢樣品加入其他各孔，每個(gè)待檢樣本加兩孔，每孔100μL,37℃反應(yīng)60min。2.2.7重復(fù)2.2.2。2.2.8每孔加100μL工作濃度的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗p27蛋白抗體，37℃反應(yīng)60min。22.2.9重復(fù)2.2.2。2.2.10每孔加100μL新配制的底物溶液，室溫，避光反應(yīng)10min。2.2.11每孔加100μL終止液。2.2.12置酶聯(lián)檢測(cè)儀于450nm測(cè)定各孔吸光度(OD)值。2.3結(jié)果判定2.3.1陰性對(duì)照OD均值等于(A?孔OD值+A?孔OD值)/2;陽(yáng)性對(duì)照OD均值等于(A?孔OD值+A?孔OD值)/2。2.3.2陰性對(duì)照OD均值小于0.15,陽(yáng)性對(duì)照OD均值減去陰性對(duì)照OD均值大于0.3時(shí)試驗(yàn)成立，否則重做。2.3.3S/P等于(樣品孔OD均值一陰性對(duì)照OD均值)÷(陽(yáng)性對(duì)照OD均值一陰性對(duì)照OD均值)。待檢樣本S/P小于等于0.2判為陰性，表示待檢樣品中無(wú)ALVsp27蛋白抗原。待檢樣本S/P大于0.2判為陽(yáng)性，表示待檢樣品中有ALVsp27蛋白抗原。(規(guī)范性附錄)試劑的配制A.1磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/LpH7.4)氯化鈉氯化鉀磷酸二氫鉀十二水磷酸氫二鈉蒸餾水碳酸鈉碳酸氫鈉蒸餾水加至1000mL加至1000mLA.3洗滌液A.4樣品稀釋液含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清的洗滌液。A.5磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH5.0)檸檬酸十二水磷酸氫二鈉蒸餾水A.6底物溶液磷