生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種的制作方法

生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種的制作方法專利名稱：生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及一種利用生物工程方法構(gòu)建的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種。背景技術(shù)：在啤酒釀造過程中，雙乙酰是影響啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，也是決定啤酒成熟與否的重要指標(biāo)，因此在整個發(fā)酵過程中嚴(yán)格控制雙乙酰的產(chǎn)生量是至關(guān)重要的。a-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)能將啤酒生產(chǎn)過程中雙乙酰的前驅(qū)物質(zhì)a-乙酰乳酸迅速分解為乙偶姻，從而快速地降低啤酒中雙乙酰的含量。隨著對a-乙酰乳酸脫羧酶研究的不斷深入及其在分子生物學(xué)技術(shù)上的發(fā)展，構(gòu)建a-乙酰乳酸脫羧酶酶活較高，能迅速將or乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻，從而降低雙乙酰含量、縮短啤酒熟化期的啤酒酵母基因工程菌已成為必然趨勢。釀酒酵母體內(nèi)不含有ALDC，因此，外源引入ALDC發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其組成包括菌株l-27和出發(fā)菌株，拉丁文名Sflcdraiwwj;cescerev/s/fle，該酵母保藏于CCTCC保藏號M207162。生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，菌株1-27和出發(fā)菌株在培養(yǎng)時間為36h，培養(yǎng)溫度為30t，接種量為10%的條件下經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，以3%的接種量轉(zhuǎn)接入700毫升(mL)麥芽汁培養(yǎng)基中，用封口膜封口，保證厭氧條件，13'C靜止培養(yǎng)，每隔1天取樣測各發(fā)酵參數(shù)，包括雙乙酰，乙醛等。結(jié)果顯示，在整個發(fā)酵過程中的從起始到最終，轉(zhuǎn)化菌株1一27發(fā)酵液中的雙乙酰含量都要比原始菌株低，轉(zhuǎn)化菌株最大值為0.04806百萬分摩爾(ppm)，最小值為0.01872ppm。原始菌株最大值為0.05578ppm，最小值為0.01826ppm。在發(fā)酵第八天轉(zhuǎn)化菌株的雙乙酰含量達(dá)到0.02494ppm，最終的雙乙酰含量達(dá)到0.01788ppm。原始菌株與轉(zhuǎn)化菌株1—27在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的乙醛含量無明顯區(qū)別，且含量均小于10ppm。由此可見，轉(zhuǎn)化菌株體內(nèi)的a—乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)發(fā)揮了作用，它使轉(zhuǎn)化菌株雙乙酰的含量有了下將，同時，乙醛的含量也沒有超出閾值，說明我們構(gòu)建的低雙乙酰酵母已經(jīng)成功。生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是菌株大小介于2.0-3.0微米(nm)，圓形。在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)固體培養(yǎng)基表面生長較快，48小時后菌落大小為2.0-3.0亳米(mm),菌落乳白色，質(zhì)地均勻，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，所述的YPD培養(yǎng)基，其成分為1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，121°0滅菌30分鐘(min)。30'C培養(yǎng)48小時(h)。生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，所述的HDY-01菌種培育方法選取工業(yè)用釀酒酵母菌株，進(jìn)行ALDC的克隆及pGM-ALDC(質(zhì)粒名稱，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實驗室自行構(gòu)建)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒DNApYC6/CT-ALDC(質(zhì)粒名稱，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實驗室自行構(gòu)建)的構(gòu)建、獲得含有ALDC釀酒酵母、pYC6/CT-ALDC轉(zhuǎn)化釀酒酵母HDY-01。生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，^丄Z)C的克隆及pGM-ALDC重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄的枯草芽孢桿菌^:/C基因序列(L04470)，設(shè)計一對特異性引物，在5'端引物和3'端引物分別加上內(nèi)切酶&oWI和Aazz/WI的識別位點(diǎn)，該引物由上海生工有限公司合成，濃度20D;上游5，ACTGMTTCATGAAACGAGAAAGCAACATTfcoWI下游3，CATGGATCCTTATTCAGGGCTTCCTTCAGT細(xì)〃I以枯草芽孢桿菌為模板直接進(jìn)行菌落PCR，94'C變性5分鐘，94-C變性30秒，53'C退火30秒，72r延伸l分鐘，35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物與T-vector的連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Z^5ff中，提取重組子質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pGM-ALDC，該質(zhì)粒中含有ALDC基因片段。生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，所述的重組質(zhì)粒DNApYC6/CT-ALDC的構(gòu)建方法將pGM-ALDC和pYC6/CT分別用fcoVI和5孤#I雙酶切后再進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Z^5",并將陽性克隆擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，并進(jìn)行PCR驗證，獲得pYC6/CT-ALDC重組質(zhì)粒。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是含有ALDC釀酒酵母的獲得方法，將pYC6/CT-ALDC轉(zhuǎn)化釀酒酵母HDY-01:利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將HDY-Ol菌株在YPD培養(yǎng)及上進(jìn)行活化，三區(qū)劃線，將單菌落接種于10毫升YPD液體培養(yǎng)基，3(TC每分鐘180轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)過夜，測定菌液的OD值，使其稀釋至50毫升時0D^達(dá)到0.4,繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時，將酵母菌培養(yǎng)液在無菌條件下室溫1500克離心5分鐘，棄上清，加入40毫升1XTE溶液將沉淀懸浮洗滌，1500克離心5分鐘棄上清，加入2毫升IXLiAc/0.5XTE溶液，懸浮沉淀后，室溫放置IO分鐘，在一無菌離心管中分別加入100uL經(jīng)過處理的酵母菌懸液，100ug變性鮭精DNA，1ugpYC-ALDCDNA，700ullXLiAc/40%PEG-4000/1XTE混合，同時取另一無菌離心管，分別加入100uL經(jīng)過處理的酵母菌懸液，100ug變性鮭精DNA，700u11XLiAc/40%PEG-4000/1XTE混合，作為對照，30'C反應(yīng)30分鐘，加8uLDMS0原液，混合均勻，40'C水浴7分鐘，在每分鐘13000轉(zhuǎn)離心10秒，棄上清，1XTE洗滌沉淀兩次加lmLTE洗滌，14000rpm離心10s,吸取上清，加入0-100yLlXTE，稀釋后涂布于含有Blasticidin的平板上30'C培養(yǎng)2天。這個技術(shù)方案有以下有益效果通過本發(fā)明，成功構(gòu)建了釀酒酵母的低雙乙酰產(chǎn)生菌1一27。1—27經(jīng)過連續(xù)15天發(fā)酵實驗證明，其雙乙酰含量和乙醛含量均較出發(fā)菌株有所降低。表達(dá)重組子的驗證將轉(zhuǎn)化的菌株涂布在含有50ng/mL的BlasticidinYPD平板上時，將未轉(zhuǎn)化的菌株也涂布在相同濃度的BlasticidinYPD平板上作為負(fù)對照，原始菌株由于不含Blasticidin抗性基因而對Blasticidin敏感，不能在含有Blasticidin的平板上生長，而轉(zhuǎn)化菌株由于含有Blasticidin抗性基因而能7夠在含有Blasticidin的平板上生長。則可在長出的菌落中挑取陽性克隆傳代五次，以保證其遺傳穩(wěn)定。本發(fā)明的含有ALDC釀酒酵母重組子1一27的性能重組子ALDC酶活的測定根據(jù)乙偶姻在堿性條件下可以與肌酸和a-萘酚的混合物反應(yīng)生成紅色的物質(zhì)，在一定的范圍內(nèi)生成的紅色物質(zhì)的吸光值和乙偶姻的含量成正比的原理，測定a-乙酰乳酸脫羧酶的活性。一個單位酶活(1U)定義為在30'C，p服.0的反應(yīng)條件下，l分鐘使a-乙酰乳酸脫羧形成lumol乙偶姻的酶量。重組子經(jīng)lOmLe-半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)在30'C、160r/min、培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接入lOOmLYPD培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體，0.859MfeCl洗滌2次后懸浮，超聲波破碎(冰浴，全程5min作用10s間隔30s功率600w),離心除去菌體碎片取上清，200iiL酶樣與200iiL底物混合在30。C水浴20min,加入4.6mL顯色劑室溫放置50min，522nm下測定吸光值。有四個重組子表達(dá)了ALDC酶活，分別為1-27(0.0081±0.00018U/mL)、1—34(0.0072土0.00027U/mL)、3_4(0.0054±0.00024U/mL)、3—12(0.0049±0.00047U/mL)。重組子1一27產(chǎn)酶條件的優(yōu)化利用單因素(時間12，24,36，48，60,72h，;溫度25,28，30，33。C;接種量2%,4%，6%，8%，10%;培養(yǎng)基麥芽汁，YPD)和正交試驗設(shè)計，優(yōu)化重組子i一27的最佳產(chǎn)酶條件。接種量和溫度是影響^:zc產(chǎn)酶的關(guān)鍵因子，其次為培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間為36h，培養(yǎng)溫度為30'C,接種量為10%為JZZC最適產(chǎn)酶條件。對此最適條件進(jìn)行驗證表明，在36h,30'C,10%接種量的條件下，酶活達(dá)到0.0087U/mL。出發(fā)菌株、l一27的發(fā)酵試驗菌株1-27和出發(fā)菌株在培養(yǎng)時間為36h，培養(yǎng)溫度為30'C，接種量為10%的條件下經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，以396的接種量轉(zhuǎn)接入700mL麥芽汁培養(yǎng)基中，用封口膜封口，保證厭氧條件，13'C靜止培養(yǎng)，每隔l天取樣測各發(fā)酵參數(shù)，包括雙乙酰，乙醛等。結(jié)果顯示，在整個發(fā)酵過程中的從起始到最終，轉(zhuǎn)化菌株1一27發(fā)酵液中的雙乙酰含量都要比原始菌株低，轉(zhuǎn)化菌株最大值為0.04806卯m,最小值為0.01872卯m。原始菌株最大值為0.05578ppm，最小值為0.01826卯m。在發(fā)酵第八天轉(zhuǎn)化菌株的雙乙酰含量達(dá)到0.02494卯m，最終的雙乙酰含量達(dá)到0.01788卯m。原始菌株與轉(zhuǎn)化菌株1一27在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的乙醛含量無明顯區(qū)別，且含量均小于10ppm。由此可見，轉(zhuǎn)化菌株體內(nèi)的ALDC發(fā)揮了作用，它使轉(zhuǎn)化菌株雙乙酰的含量有了下將，同時，乙醛的含量也沒有超出閾值，說明我們構(gòu)建的低雙乙酰酵母已經(jīng)成功。本發(fā)明的具體實施例方式實施例1:生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其組成包括菌株l-27和出發(fā)菌株，拉丁文名S"ccAa/wi^"sce"WwVie，該酵母保藏于CCTCC保藏號M207162。實施例2:根據(jù)實施例1所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，菌株1-27和出發(fā)菌株在培養(yǎng)時間為36h，培養(yǎng)溫度為30'C,接種量為10%的條件下經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，以3%的接種量轉(zhuǎn)接入700毫升(mL)麥芽汁培養(yǎng)基中，用封口膜封口，保證厭氧條件，13'C靜止培養(yǎng)，每隔1天取樣測各發(fā)酵參數(shù)，包括雙乙酰，乙醛等。結(jié)果顯示，在整個發(fā)酵過程中的從起始到最終，轉(zhuǎn)化菌株1一27發(fā)酵液中的雙乙酰含量都要比原始菌株低，轉(zhuǎn)化菌株最大值為0.04806百萬分摩爾(ppm),最小值為0.01872ppm。原始菌株最大值為0.05578ppm，最小值為0.01826ppm。在發(fā)酵第八天轉(zhuǎn)化菌株的雙乙酰含量達(dá)到0.02494ppm，最終的雙乙酰含量達(dá)到0.01788ppm。原始菌株與轉(zhuǎn)化菌株1一27在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的乙醛含量無明顯區(qū)別，且含量均小于10ppm。由此可見，轉(zhuǎn)化菌株體內(nèi)的a—乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)發(fā)揮了作用，它使轉(zhuǎn)化菌株雙乙酰的含量有了下將，同時，乙醛的含量也沒有超出閾值，說明我們構(gòu)建的低雙乙酰酵母已經(jīng)成功。實施例3:根據(jù)實施例1或2所述的產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，菌株大小介于2.0-3.0微米(urn)，圓形。在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)固體培養(yǎng)基表面生長較快，48小時后菌落大小為2.0-3.0亳米(mm),菌落乳白色，質(zhì)地均勻，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。實施例4根據(jù)實施例1或2所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，所述的YPD培養(yǎng)基，其成分為1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，121aC滅菌30分鐘(min)。30'C培養(yǎng)48小時(h)。實施例5:根據(jù)實施例1或2所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，所述的HDY-01菌種培育方法為選取工業(yè)用釀酒酵母菌株,進(jìn)行ALDC的克隆及pGM-ALDC(質(zhì)粒名稱，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實驗室自行構(gòu)建)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒DNApYC6/CT-ALDC(質(zhì)粒名稱，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實驗室自行構(gòu)建)的構(gòu)建、獲得含有ALDC釀酒酵母、pYC6/CT-ALDC轉(zhuǎn)化釀酒酵母HDY-Ol。實施例6:根據(jù)實施例5所述的所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，J￡Z>C的克隆及pGM-ALDC重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄的枯草芽孢桿菌力ZZC基因序列(L04470),設(shè)計一對特異性引物，在5'端引物和3，端引物分別加上內(nèi)切酶&:^I和"afl7i7I的識別位點(diǎn)，該引物由上海生工有限公司合成，濃度2OD;上游5，ACTGMTTCATGAAACGAGAAAGCAACATTfco#I下游3，CATGGATCCTTATTCAGGGCTTCCTTCAGT細(xì)#I以枯草芽孢桿菌為模板直接進(jìn)行菌落PCR,94。C變性5分鐘，94。C變性30秒，53'C退火30秒，72'C延伸1分鐘，35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物與T-vector的連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ZW5ff中，提取重組子質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pGM-ALDC，該質(zhì)粒中含有ALDC基因片段。實施例7:根據(jù)實施例5所述的產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，所述的重組質(zhì)粒DNApYC6/CT-ALDC的構(gòu)建方法將pGM-ALDC和pYC6/CT分別用五co/I和萬孤#I雙酶切后再進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌/^5"，并將陽性克隆擴(kuò)增，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，并進(jìn)行PCR驗證，獲得pYC6/CT-ALDC重組質(zhì)粒。實施例8:根據(jù)實施例7所述的產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，含有ALDC釀酒酵母的獲得方法，將pYC6/CT-ALDC轉(zhuǎn)化釀酒酵母HDY-01:利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將HDY-Ol菌株在YPD培養(yǎng)及上進(jìn)行活化，三區(qū)劃線，將單菌落接種于10毫升YPD液體培養(yǎng)基，301C每分鐘180轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)過夜，測定菌液的0D值，使其稀釋至50毫升時0D6。。達(dá)到0.4，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時，將酵母菌培養(yǎng)液在無菌條件下室溫1500克離心5分鐘，棄上清，加入40毫升1XTE溶液將沉淀懸浮洗滌，1500克離心5分鐘棄上清，加入2毫升IXLiAc/0.5XTE溶液，懸浮沉淀后，室溫放置IO分鐘，在一無菌離心管中分別加入100uL經(jīng)過處理的酵母菌懸液，100iig變性鮭精DNA，1ixgpYC-ALDCDNA，700u11XLiAc/4(mPEG-4000/lXTE混合，同時取另一無菌離心管，分別加入100uL經(jīng)過處理的酵母菌懸液，lOOyg變性鮭精DNA，700u11XLiAc/40%PEG-4000/1XTE混合，作為對照，3(TC反應(yīng)30分鐘，加8uLDMS0原液，混合均勻，40'C水浴7分鐘，在每分鐘13000轉(zhuǎn)離心10秒，棄上清，1XTE洗滌沉淀兩次加lmLTE洗滌，14000rpm離心10s，吸取上清，加入0-100uLlXTE，稀釋后涂布于含有Blasticidin的平板上30'C培養(yǎng)2天。專利用菌種釀酒酵母1一27(5"acc力aro/B7cescereyiw'ae)CCTCCM207162保藏日期2007年10月16日。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其組成包括菌株1-27和出發(fā)菌株，其特征是拉丁文名Saccharomycescerevisiae，該酵母保藏于CCTCC保藏號M207162。。2.根據(jù)權(quán)要求1所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種,其特征是:菌株1-27和出發(fā)菌株在培養(yǎng)時間為36h，培養(yǎng)溫度為3(TC,接種量為10%的條件下經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后，以3%的接種量轉(zhuǎn)接入700毫升(mL)麥芽汁培養(yǎng)基中，用封口膜封口，保證厭氧條件，13'C靜止培養(yǎng)，每隔1天取樣測各發(fā)酵參數(shù)，包括雙乙酰，乙醛等。結(jié)果顯示，在整個發(fā)酵過程中的從起始到最終，轉(zhuǎn)化菌株1一27發(fā)酵液中的雙乙酰含量都要比原始菌株低,轉(zhuǎn)化菌株最大值為0.04806百萬分摩爾(ppm)，最小值為0.01872ppm。原始菌株最大值為0.05578ppm，最小值為0.01826ppm。在發(fā)酵第八天轉(zhuǎn)化菌株的雙乙酰含量達(dá)到0.02494ppm，最終的雙乙酰含量達(dá)到0.01788ppm。原始菌株與轉(zhuǎn)化菌株1一27在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液中的乙醛含量無明顯區(qū)別，且含量均小于10ppm。由此可見，轉(zhuǎn)化菌株體內(nèi)的a—乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)發(fā)揮了作用，它使轉(zhuǎn)化菌株雙乙酰的含量有了下將，同時，乙醛的含量也沒有超出閾值，說明我們構(gòu)建的低雙乙酰酵母已經(jīng)成功。3.根據(jù)權(quán)要求1或2所述的產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是菌株大小介于2.0-3.0微米(nm)，圓形。在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)固體培養(yǎng)基表面生長較快，48小時后菌落大小為2.0-3.0毫米(mm),菌落乳白色，質(zhì)地均勻，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是所述的YPD培養(yǎng)基，其成分為1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，121'C滅菌30分鐘(min)。30。C培養(yǎng)48小時(h)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是所述的HDY-01菌種培育方法為選取工業(yè)用釀酒酵母菌株，進(jìn)行ALDC的克隆及pGM-ALDC(質(zhì)粒名稱，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實驗室自行構(gòu)建)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒DNApYC6/CT-ALDC(質(zhì)粒名稱，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實驗室自行構(gòu)建)的構(gòu)建、獲得含有ALDC釀酒酵母、pYC6/CT-ALDC轉(zhuǎn)化釀酒酵母HDY-Ol。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的所述的生產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是J1DC的克隆及pGM-ALDC重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄的枯草芽孢桿菌y^"C基因序列(L04470)，設(shè)計一對特異性引物，在5'端引物和3，端引物分別加上內(nèi)切酶^"WI和5碰VI的識別位點(diǎn)，該引物由上海生工有限公司合成，濃度20D;上游5，ACTGAATTCATGAAACGAGAAAGCAACATTAcoVI下游3,CATGGATCCTTATTCAGGGCTTCCTTCAGTto#I以枯草芽孢桿菌為模板直接進(jìn)行菌落PCR,94'C變性5分鐘，94'C變性30秒，53'C退火30秒，72'C延伸1分鐘，35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物與T-vector的連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ZW5〃中，提取重組子質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pGM-ALDC,該質(zhì)粒中含有ALDC基因片段。7.根據(jù)權(quán)要求5所述的產(chǎn)低雙乙酰啤酒的酵母菌種，其特征是所述的重組質(zhì)粒DNApYC6/CT-ALDC的構(gòu)建方法將pGM-ALDC和pYC6/CT分別用fcoiI和5affl〃I雙酶切后再進(jìn)行連