工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基

關(guān)于工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基知識目標(biāo)

1、了解工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基原料轉(zhuǎn)換的意義

2、了解工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基配方設(shè)計的一般思路

3、理解影響工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的因素

4、掌握工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分及其作用

5、掌握工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要類型及其特征能力目標(biāo)

1、能正確選擇工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的原料

2、能配制適合不同發(fā)酵階段需要的培養(yǎng)基

第2頁,共62頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基（Medium）

：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細(xì)胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料。是人工配制的供微生物、植物和動物細(xì)胞生長、繁殖和合成人們所需要產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)和原料，同時培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它生長所必須的環(huán)境條件。發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長促進產(chǎn)物的形成概述第3頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分

工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基與實驗室培養(yǎng)基的成分基本相同，一般都含有碳源、氮源、無機鹽（包括微量元素）以及生長因子和水等。此外，為了合成特殊產(chǎn)物或工藝控制要求，有的發(fā)酵培養(yǎng)基還需加入前體、抑制劑、促進劑或消沫劑等。第4頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、碳源：凡是能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)叫做碳源。包含速效碳，緩效碳。

1.糖類：

2.油脂：

3.有機酸、醇、碳?xì)浠衔锏?頁,共62頁，2024年2月25日，星期天李江華，無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2004(半纖維素酶)(1.5g麩皮)第6頁,共62頁，2024年2月25日，星期天嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對堿性纖維素酶分泌的影響結(jié)果：各種碳源相差不大推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型蘇勤，林業(yè)化學(xué)與工業(yè)，2004第7頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1、糖類①單糖：葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖但是會引起葡萄糖效應(yīng)：菌體呼吸快、溶解氧不足，導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物積累，pH下降，抑制生長和產(chǎn)物形成。②

雙糖：蔗糖、乳糖、麥芽糖糖蜜第8頁,共62頁，2024年2月25日，星期天糖蜜糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達(dá)50%～75%。第9頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共62頁，2024年2月25日，星期天不同加工方法對甘蔗糖蜜的影響第11頁,共62頁，2024年2月25日，星期天糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）預(yù)處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）預(yù)處理：→黃血鹽第12頁,共62頁，2024年2月25日，星期天③多糖：淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等難利用、發(fā)酵液比較稠、一般加入一定的α-淀粉酶。優(yōu)點：來源廣泛、價格低，可以解除葡萄糖效應(yīng)第13頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.油脂：霉菌和放線菌可以利用油脂作為碳源，有消沫和補充碳源雙重作用，但必需提供充足氧氣，否則有機酸積累，pH下降，同時儲存過程酸敗作用產(chǎn)生毒副作用。3.有機酸、醇、碳?xì)浠衔铮耗承┯袡C酸、醇在單細(xì)胞蛋白、氨基酸、維生素生產(chǎn)中作為碳源使用，而石油產(chǎn)品作為微生物發(fā)酵的主要原料也在深入研究和推廣之中。第14頁,共62頁，2024年2月25日，星期天二、氮源

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。包含速效氮，緩效氮，常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。

1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之為速效氮，有利于微生物生長。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH第15頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH第16頁,共62頁，2024年2月25日，星期天無機氮源的影響：硫酸銨>硝酸銨>硝酸鈉>尿素第17頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2、有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等第18頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

有機氮源成分復(fù)雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響第19頁,共62頁，2024年2月25日，星期天氮源使用的一些相關(guān)問題：

有機氮源和無機氮源應(yīng)當(dāng)混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)

有些產(chǎn)物會受氮源的誘導(dǎo)和阻遏例：蛋白酶的生產(chǎn)

有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣的課題第20頁,共62頁，2024年2月25日，星期天三、無機鹽及微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定4、使用注意點

對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮第21頁,共62頁，2024年2月25日，星期天例：鐵離子青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)α-淀粉酶，P對酶活的影響

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘第22頁,共62頁，2024年2月25日，星期天四、生長因子、前體和產(chǎn)物促進劑

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

1、生長因子

如以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子,生長因子對發(fā)酵的調(diào)控起到重要的作用。

有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機氮源含有較多的B簇維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子第23頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第24頁,共62頁，2024年2月25日，星期天作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個轉(zhuǎn)化率的問題例：6000單位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉(zhuǎn)化率在46-90%之間例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉(zhuǎn)化率為：0.6/(0.337*36/13.8)=68%第25頁,共62頁，2024年2月25日，星期天用法：前體使用時普遍采用流加的方法

前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前提的轉(zhuǎn)化率第26頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3、產(chǎn)物促進劑所謂產(chǎn)物促進劑是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。第27頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細(xì)胞的透性，改善細(xì)胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認(rèn)為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。第28頁,共62頁，2024年2月25日，星期天五、水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。第29頁,共62頁，2024年2月25日，星期天六、消沫劑消沫劑又稱泡敵、消泡劑，是一種化學(xué)合成制品。屬“非離子表面活劑”的一種，產(chǎn)品為無色或淡黃色粘稠液體。用途：

可廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)抗生素生產(chǎn)，味精食品的生產(chǎn)以及其他發(fā)酵工業(yè)，有效強的消泡效果。它的消泡率比食用豆油的消泡率高達(dá)幾十倍。也可供油田打井時泥漿材料的消泡。（食用豆油：常用于食品類發(fā)酵食品的消泡）第30頁,共62頁，2024年2月25日，星期天消沫劑-聚醚消沫劑G·P·E

1、活性成份:聚氧丙烯聚氧乙烯有規(guī)二醇或三醇醚。2、物理特性:外觀:淺黃色至無色透明粘稠液體，羥值:45-56mgKOH/g，濁點:17-22℃(1%水溶液)，酸值:≤0.5mgKOH/g，分子量:3000-3800。3、產(chǎn)品簡介:本品主要針對發(fā)酵工業(yè)消泡而設(shè)計，根據(jù)實踐使用作了多次重要改進，是一支特別成熟、競爭力很強的產(chǎn)品，比一般的聚醚型消沫劑要節(jié)藥10-20%使用量，主要應(yīng)用于土霉素、青毒素、四環(huán)素、鏈霉素、潔霉素、紅霉素、利福平、阿維菌素、賴氨酸、酵母等發(fā)酵過程中消泡。也可以應(yīng)用于合成纖維油劑、乳化劑、低泡清洗劑等行業(yè)。4、使用方法:在制藥發(fā)酵中使用，可以與基礎(chǔ)料一起配入，也可分消進罐，一般使用量在0.3-0.5‰左右。5、包裝貯運:本品采用200kg鍍鋅鐵桶包裝。常溫下貯存期一年內(nèi)有效。

第31頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的類型和配方設(shè)計

目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

第32頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、培養(yǎng)基的類型一、按純度分合成培養(yǎng)基：是由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。半合成培養(yǎng)基：既有天然有機物，又有化學(xué)試劑配制的培養(yǎng)基。

天然培養(yǎng)基：利用動、植物或微生物包括其提取物制成的培養(yǎng)基。如：麥芽汁培養(yǎng)基。第33頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。第34頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3、按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用考慮）孢子（斜面）培養(yǎng)基：活化菌種、制備孢子用（斜面培養(yǎng)基）種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽和菌體繁殖用，其質(zhì)量對發(fā)酵水平影響很大。發(fā)酵培養(yǎng)基：供菌體生長繁殖和和合成大量代謝產(chǎn)物用，要求培養(yǎng)基的組成豐富完整。

第35頁,共62頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基的設(shè)計

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的

合理的實驗方法多因子實驗：均勻設(shè)計、正交實驗設(shè)計、響應(yīng)面分析等。多因子實驗第36頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3）采用多因子實驗，包含均勻設(shè)計、正交實驗設(shè)計、響應(yīng)面分析等方法在搖瓶水平優(yōu)化培養(yǎng)基的配方。4）小試、中試發(fā)酵罐規(guī)模進一步優(yōu)化配方；5）規(guī)?；a(chǎn)（工業(yè)生產(chǎn)）優(yōu)化培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)基設(shè)計的思路1）根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；2）通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；第37頁,共62頁，2024年2月25日，星期天類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健第38頁,共62頁，2024年2月25日，星期天原培養(yǎng)基:第39頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第40頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好第41頁,共62頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽:復(fù)合無機鹽0.05%第42頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

正交設(shè)計確定優(yōu)化的配方第43頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共62頁，2024年2月25日，星期天改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基改進培養(yǎng)基后的發(fā)酵結(jié)果第45頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

搖瓶水平到反應(yīng)器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應(yīng)器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設(shè)計的第一步

反應(yīng)器—最終的優(yōu)化的基礎(chǔ)配方第46頁,共62頁，2024年2月25日，星期天例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)差別很大第47頁,共62頁，2024年2月25日，星期天搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)第48頁,共62頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵罐：反應(yīng)器水平,可以得出最終優(yōu)化的基礎(chǔ)配方第49頁,共62頁，2024年2月25日，星期天pH控制搖床：反應(yīng)器水平上的搖瓶研究第50頁,共62頁，2024年2月25日，星期天考慮培養(yǎng)基總體要求時應(yīng)注意的問題1、營養(yǎng)豐富、有產(chǎn)物合成的潛力。2、各原材料之間不反應(yīng)，理化性質(zhì)相對穩(wěn)定。3、粘度適中，具有適當(dāng)?shù)臐B透壓。4、利于產(chǎn)物的合成并能維持較長時間的最高生產(chǎn)速率。5、生產(chǎn)過程不影響通氣與攪拌，又不影響產(chǎn)物的精制和廢物處理。第51頁,共62頁，2024年2月25日，星期天6、原材料的選擇要因地制宜，質(zhì)優(yōu)價廉。成本低，來源充足。7、要考慮速效與遲效碳、氮源的相互配合。8、選用適當(dāng)?shù)奶嫉?、注意生理酸堿性鹽和pH緩沖劑的加入和搭配。10、培養(yǎng)基成分量的確定大部分根據(jù)經(jīng)驗而定，有些可以根據(jù)物料平衡計算加以確定。第52頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素

水質(zhì)的影響

原材料的質(zhì)量

滅菌的影響

在工業(yè)發(fā)酵過程中，常出現(xiàn)生產(chǎn)水平大幅度波動或菌體代謝異?，F(xiàn)象，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因是種子質(zhì)量不穩(wěn)定、發(fā)酵工藝控制不嚴(yán)等，其中培養(yǎng)基質(zhì)量也是一個重要因素。引起培養(yǎng)基質(zhì)變的因素主要有：第53頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、原材料的影響有機氮源的原材料質(zhì)量是引起生產(chǎn)水平波動的主要因素之一。（原材料品種、產(chǎn)地、加工方法、貯存條件等）碳源影響不如氮源顯著，但也能較大幅度引起發(fā)酵水平波動。無機鹽和前體等化學(xué)物質(zhì)組成明確，有一定的質(zhì)量規(guī)格，較易控制。第54頁,共62頁，2024年2月25日，星期天原材料選擇原則原材料的質(zhì)量對培養(yǎng)基的質(zhì)量直接產(chǎn)生影響，因此在工業(yè)生產(chǎn)中，為了穩(wěn)定生產(chǎn)水平和提高產(chǎn)量和質(zhì)量，對所采用的全部原材料的質(zhì)量要嚴(yán)格控制，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格檢測，如果要改換原材料的品種時，必需先進行小試、甚至中試，確信對生產(chǎn)沒有影響時，才能用于實際生產(chǎn)，對不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)工藝要求的原材料不能隨意用于生產(chǎn)。第55頁,共62頁，2024年2月25日，星期天二、水質(zhì)的影響水是構(gòu)成培養(yǎng)基的主要原材料之一，水的質(zhì)量對許多產(chǎn)品直接產(chǎn)生影響。大生產(chǎn)中常使用的水有深井水、自來水、地表水和純凈水。不同來源的水的質(zhì)量與環(huán)境條件有關(guān)。生產(chǎn)中對水的質(zhì)量要定期檢測，地表水要適當(dāng)處理方能使用。第56頁,共62頁，2024年2月25日，星期天三、滅菌的影響

在大規(guī)模發(fā)酵中應(yīng)該盡可能的采取連續(xù)滅菌的操作，而且保證滅菌條件