微生物檢驗(yàn)方法

關(guān)于微生物檢驗(yàn)方法一、總則二、菌落總數(shù)三、糞大腸菌群四、霉菌和酵母菌第2頁,共24頁，2024年2月25日，星期天一、總則1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本要求。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。

2.儀器和設(shè)備天平高壓滅菌器振蕩器三角瓶(250mL)玻璃珠玻璃棒刻度吸管(1mL、10mL)研缽或均質(zhì)器恒溫水浴箱第3頁,共24頁，2024年2月25日，星期天生理鹽水(成分：氯化鈉8.5g)蒸餾水加至1000mL,溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內(nèi)，每瓶90mL，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌。SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.2～7.3分裝，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25℃左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。滅菌液體石蠟。滅菌吐溫80。3.培養(yǎng)基和試劑第4頁,共24頁，2024年2月25日，星期天所采集的樣品，應(yīng)具有代表性。供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。若只有一個樣品而同時需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個月。4樣品的采集及注意事項(xiàng)第5頁,共24頁，2024年2月25日，星期天液體樣品水溶性的液體樣品，可量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL，仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5mL則加到45mL滅菌生理鹽水，混勻后，制成1：10檢液。油性液體樣品，取樣品10mL，先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80，在40℃～44℃水浴中振蕩混合10min，加入滅菌的生理鹽水75mL（在40℃～44℃水浴中預(yù)溫），在40℃～44℃水浴中乳化，制成1：10的懸液。5供檢樣品的制備

膏、霜、乳劑半固體狀樣品

親水性的樣品：稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1:10的檢液。疏水性樣品：稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10檢液。第6頁,共24頁，2024年2月25日，星期天

固體樣品稱取10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1：10的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min～2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL吐溫80，70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min～5min。第7頁,共24頁，2024年2月25日，星期天二、菌落總數(shù)1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測定。2定義菌落總數(shù)（Aerobicbacterialcount）是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評價的綜合依據(jù)。第8頁,共24頁，2024年2月25日，星期天3儀器和設(shè)備

三角瓶，250mL。

量筒，200mL。pH計或精密pH試紙。高壓滅菌器。試管：15×150mm。滅菌平皿：直徑9cm。滅菌刻度吸管，10mL、1mL。酒精燈。恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。放大鏡。第9頁,共24頁，2024年2月25日，星期天生理鹽水卵磷脂、吐溫80—營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15g、卵磷脂1g、吐溫807g、蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調(diào)pH值為7.1～7.4，加入瓊脂，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。0.5％氯化三苯四氮唑成分：TTC0.5g蒸餾水100mL溶解后過濾，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。4培養(yǎng)基和試劑第10頁,共24頁，2024年2月25日，星期天(1)用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，制成1：100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：10001:10000，……等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。(2)將融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h，為空白對照。5操作步驟(3)為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5％的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。第11頁,共24頁，2024年2月25日，星期天6菌落計數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5倍～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。第12頁,共24頁，2024年2月25日，星期天

(1)首先選取平均菌落數(shù)在30個～300個之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍。當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表1中例1）。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1例5）。7菌落計數(shù)及報告方法

(5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30個～300個之間，其中一個稀釋度大于300個，而相鄰的另一稀釋度小于30個時，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例6）。(3)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋

(2)若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30個～300個之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表1中例2及例3）。第13頁,共24頁，2024年2月25日，星期天(6)若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，按實(shí)有數(shù)值報告之，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數(shù)為“不可計”時，應(yīng)注明樣品的稀釋度。第14頁,共24頁，2024年2月25日，星期天三、糞大腸菌群1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2定義糞大腸菌群系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌直接來自糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。滅菌平皿：直徑90mm。第15頁,共24頁，2024年2月25日，星期天3儀器恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44℃±0.5℃。溫度計顯微鏡載玻片

接種環(huán)電磁爐三角瓶，250mL試管：15×150mm小倒管pH計或pH試紙

高壓滅菌器。

滅菌吸管，10mL、1mL

滅菌平皿：直徑90mm4培養(yǎng)基和試劑

雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g

0.4％溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫8014g蒸餾水1000mL制法：將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào)pH到7.4，加入0.4％溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管（每支試管中加一個小倒管）。68.95kPa（115℃10lb）20min滅菌。第16頁,共24頁，2024年2月25日，星期天伊紅美蘭（EMB）瓊脂成分：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂20g、2％伊紅水溶液20mL、0.5％美藍(lán)水溶液13mL、蒸餾水1000mL蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL

雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g

0.4％溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫8014g蒸餾水1000mL4培養(yǎng)基和試劑

革蘭氏碘液成分：碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL

革蘭氏染色液

靛基質(zhì)試劑成分：結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g

95％乙醇20mL

1％草酸銨水溶液80mL第17頁,共24頁，2024年2月25日，星期天

脫色液：95％乙醇。

復(fù)染液：（1）沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g、95％乙醇10mL、蒸餾水90mL（2）稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95％乙醇100mL，放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL，加5％石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復(fù)紅液。染色法（1）將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。（2）滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。(3)滴加95％乙醇脫色，約30s，或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s，水洗。(4)滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。(5)染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時間僅需10s。第18頁,共24頁，2024年2月25日，星期天(1)取10mL1：10稀釋的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置44℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為糞大腸菌群陰性。(2)如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時取該培養(yǎng)液1～2滴接種到蛋白胨水中，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。(3)挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。(4)在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。6檢驗(yàn)結(jié)果報告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。5操作步驟第19頁,共24頁，2024年2月25日，星期天四、霉菌和酵母菌1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中霉菌和酵母菌數(shù)的檢測方法。本規(guī)范適用于各種化妝品中霉菌和酵母菌的計數(shù)。2定義霉菌和酵母菌數(shù)測定是指化妝品檢樣在一定條件下培養(yǎng)后，1g或1mL化妝品中所污染的活的霉菌和酵母菌數(shù)量，藉以判明化妝品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般衛(wèi)生狀況。本方法根據(jù)霉菌和酵母菌特有的形態(tài)和培養(yǎng)特性，在虎紅培養(yǎng)基上，置28℃±2℃培養(yǎng)72h，計算所生長的霉菌和酵母菌數(shù)。第20頁,共24頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)箱：28℃±2℃。振蕩器。天平。三角瓶，250mL。

試管：15×150mm。

平皿：直徑9cm。吸管，1mL、10mL。

量筒，200mL。

酒精燈。高壓滅菌器。3儀器和