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文檔簡介
關(guān)于常見問題分析及解決策略PCR技術(shù)簡介PCR常見問題、原因分析及其解決方案提高PCR反應(yīng)特異性的策略臨床PCR檢測的常見問題定量PCR常見問題第2頁,共27頁,2024年2月25日,星期天PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系DNA模板引物反應(yīng)緩沖液Mg2+濃度
dNTPsdH2O
耐熱聚合酶第3頁,共27頁,2024年2月25日,星期天反應(yīng)體系對PCR擴增的影響DNA模板純度蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性
模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物濃度加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加引物特異性長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性避免反復(fù)凍融濃度應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,
過低則擴增產(chǎn)物太少第4頁,共27頁,2024年2月25日,星期天反應(yīng)體系對PCR擴增的影響過高非特異性嚴(yán)重過低無擴增產(chǎn)物濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融pH值適當(dāng)避免污染pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強劑反應(yīng)緩沖液dNTPsdH2OMg2+濃度第5頁,共27頁,2024年2月25日,星期天如何選擇最合適的DNA聚合酶PCR用耐熱DNA聚合酶Taq酶pfu酶HotstartTaq酶混合酶Taq
plusLongTaqTaqplatinum第6頁,共27頁,2024年2月25日,星期天特異性-----基因組擴增、RT-PCR保真性-----基因篩選、測序、克隆長片段擴增-----構(gòu)建基因圖譜、測序等擴增效率-----復(fù)雜模板擴增(GC含量高、二級結(jié)構(gòu))PCR試劑盒-----復(fù)雜模板擴增、大規(guī)模基因檢測如何選擇最合適的DNA聚合酶-----根據(jù)PCR實驗需求第7頁,共27頁,2024年2月25日,星期天PCR常見問題之一-----無擴增產(chǎn)物現(xiàn)象:正對照有條帶,而樣品則無
M12正對照原因模板含有抑制物,含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時間太短純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu))或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間對策第8頁,共27頁,2024年2月25日,星期天PCR常見問題之二-----非特異性擴增現(xiàn)象:PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。原因?qū)Σ咭锾禺愋圆钅0寤蛞餄舛冗^高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)第9頁,共27頁,2024年2月25日,星期天PCR常見問題之三-----拖尾現(xiàn)象:產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)M12原因?qū)Σ吣0宀患傿uffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)第10頁,共27頁,2024年2月25日,星期天PCR常見問題之四-----假陽性現(xiàn)象:空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物原因靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染對策操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外;除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進行分裝,然后低溫貯存。第11頁,共27頁,2024年2月25日,星期天提高PCR反應(yīng)特異性策略巢式PCR(Nest-PCR)
遞減PCR(TouchDownPCR)
熱啟動PCR(HotStartPCR)
使用PCR增強劑第12頁,共27頁,2024年2月25日,星期天策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2
巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性,因為同多套引物都互補的靶序列很少。
巢式PCR可以增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的靈敏度,并且提高了困難PCR(如5'RACE)的特異性。
第13頁,共27頁,2024年2月25日,星期天策略之二遞減PCR
遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始,然后每個循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm5℃。特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增,這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用,如AFLP、DNA指紋分析等。第14頁,共27頁,2024年2月25日,星期天策略之三熱啟動PCR
熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成,直到PCR儀達到變性溫度;現(xiàn)在有很多公司都有HotStartTaq酶出售,該酶具有熱啟動的性能,使用簡單方便,適合于高通量應(yīng)用;熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外,提高PCR特異性最重要的方法之一。第15頁,共27頁,2024年2月25日,星期天策略之四使用PCR增強劑
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強劑。其可能的機理是降低熔解溫度,從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。增強劑濃度要適當(dāng)。第16頁,共27頁,2024年2月25日,星期天熒光定量PCR常見問題熒光定量PCR擴增效率確認(rèn):相關(guān)系數(shù)(R2):大于0.98標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率:-3~-3.5PCR擴增效率(E):0.9~1.2重復(fù)性好:STD<0.2特異性好第17頁,共27頁,2024年2月25日,星期天熒光定量PCR常見問題無Ct值(信號)出現(xiàn)或出現(xiàn)過晚:陰性對照出現(xiàn)明顯的擴增:熒光PCRmix或水污染;出現(xiàn)引物二聚體:設(shè)計特異性引物。反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠;檢測熒光信號步驟有誤;引物、探針設(shè)計不佳或降解;模板量少或降解。反應(yīng)條件或體系不佳:優(yōu)化;擴增片段過長:100~200bp。第18頁,共27頁,2024年2月25日,星期天熒光定量PCR常見問題溶解曲線不止一個主峰:引物設(shè)計不佳:設(shè)計特異性引物;引物濃度不適:降低引物濃度;退火溫度低:調(diào)整退火溫度;鎂離子濃度過高:降低鎂離子濃度;模板中有基因組污染:注意提取過程;耗材儀器不匹配;反應(yīng)體系污染等:設(shè)置陽性陰性對照。第19頁,共27頁,2024年2月25日,星期天熒光定量PCR常見問題擴增效率低:重復(fù)性不好:反應(yīng)體系中部分成分尤其是熒光染料降解;反應(yīng)條件不佳:延長退火、延伸時間,改為三步法,降低退火溫度,提高引物濃度,重新設(shè)計引物;反應(yīng)體系中有抑制物:一般為模板引入。加樣不準(zhǔn)確;儀器溫度均一性不好;模板濃度低。第20頁,共27頁,2024年2月25日,星期天熒光定量PCR常見問題擴增曲線不正常:基線等設(shè)置不當(dāng):減小基線終點;模板量過多:將模板稀釋。第21頁,共27頁,2024年2月25日,星期天臨床PCR檢測的常見問題假陽性問題假陰性問題定量問題方法學(xué)問題:靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴增污染問題:樣本污染、產(chǎn)物污染試劑因素操作因素儀器因素標(biāo)本因素外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量第22頁,共27頁,2024年2月25日,星期天臨床PCR檢測常見問題解決辦法嚴(yán)格區(qū)分及實驗人員培訓(xùn);使用UNG技術(shù)。假陽性解決辦法:假陰性解決辦法:設(shè)置陽性對照監(jiān)測試劑問題;降低操作難度,提高操作人員素質(zhì);陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)曲線或使用內(nèi)對照監(jiān)控儀器故障;使用抗干擾能力強的試劑提取樣本DNA。第23頁,共27頁,2024年2月25日,星期天臨床PCR檢測常見問題解決辦法外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量:第24頁,共27頁,2024年2月25日,星期天RT常見問題
第25頁,共27頁,2024年2月25日,星期天RNA降解或起始量少RNA含抑制成分
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