培養(yǎng)基及配制

關于培養(yǎng)基及配制培養(yǎng)基的成分3碳源和能源

4植物激素

1無機鹽

2有機物5瓊脂

6輔助物質(zhì)第2頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1無機鹽

元素名稱添加形式

NKNO3,NH4NO3大量PKH2PO4NaH2PO4元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2OMgMg2SO4·7H2OSFeFeNa2-EDTA微量BH3BO3元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2·2H2O第3頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1）大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。

P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關系。第4頁,共62頁，2024年2月25日，星期天Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。第5頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2）微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大，鐵是一些氧化酶的組成成分。同時又是葉綠素形成的必要條件。

由于培養(yǎng)基的pH較高，所以培養(yǎng)中幾乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸鐵這種鰲合物來防止鐵的沉淀。第6頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關系；銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長；錳參與植物的光合、呼吸代謝；鉬參與氮素的代謝；氯是光合作用水光解的活化劑。

微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。第7頁,共62頁，2024年2月25日，星期天NoMSsalts沒有任何生長特征MSsalts0.47g.l-1

長出更多的根MSsalts9.52g.l-1

長大量的再生苗而無根第8頁,共62頁，2024年2月25日，星期天**

愈傷組織缺無機營養(yǎng)表現(xiàn)癥狀

N----某些愈傷組織出現(xiàn)花青甙，沒有導管形成

N、P或K----細胞過度增大且形成層減少

S----愈傷組織非常明顯褪綠

Fe----細胞分裂停止

B----細胞分裂和細胞伸長遲緩

Mg和Mn----影響細胞伸長第9頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2有機物2.1維生素2.2肌醇2.4氨基酸2.3天然復合物第10頁,共62頁，2024年2月25日，星期天種類：

硫胺素---維生素B1VB1

吡哆素---維生素B6VB6

煙酸---維生素B3Vpp

抗壞血酸---維生素CVc以及B5、生物素、葉酸。濃度：0.1－1.0mg/L

作用：VB1促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力VB6

促根生長Vpp與代謝和胚發(fā)育有關Vc防組織褐變2.1維生素第11頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.2肌醇促進愈傷組織生長、胚狀體和芽的形成對組織細胞繁殖、分化的促進作用濃度100mg/L第12頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2有機物2.1維生素2.2肌醇2.4氨基酸2.3天然復合物第13頁,共62頁，2024年2月25日，星期天椰乳：促愈傷組織和細胞培養(yǎng)，用量10～20%。使用注意莖尖大小。

2.3天然復合物香蕉泥：對pH值緩沖大，用量150～200ml/L，應用在蘭花組培。第14頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

水解酪(乳)蛋白：濃度100-200mg/L，多用于微莖尖培養(yǎng)。天然復合物馬鈴薯提取液：對pH值緩沖大，用量150-200g/L，使苗壯。其它：第15頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.4氨基酸

種類：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺類物質(zhì)（如天門冬酰胺）和多種氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。注意：氨基酸類物質(zhì)只有在含有無機氮的情況下，對離體組織生長才有較好的效果。第16頁,共62頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的成分第一節(jié)3碳源和能源

4植物激素

1無機鹽

2有機物5瓊脂

6輔助物質(zhì)第17頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3碳源和能源

種類：蔗糖或葡萄糖、果糖、砂糖等。蔗糖濃度：1-5%，胚培養(yǎng)為4-15%。注意：高壓滅菌部分糖會分解。大生產(chǎn)時可用白砂糖。作用：

作為離體組織賴以生長的碳源

使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓（一般在1.5-4.1MPa）第18頁,共62頁，2024年2月25日，星期天蔗糖（0%）蔗糖含量（

1%）蔗糖含量（5%）在外植體上既沒有芽發(fā)生，也沒有根和愈傷組織產(chǎn)生在外植體上表面邊緣產(chǎn)生芽，也有一些根發(fā)生芽從外植體的上表面發(fā)生而根從下表面發(fā)生第19頁,共62頁，2024年2月25日，星期天4植物激素4.1.生長素類（1）種類

IBA—吲哚丁酸；IAA—吲哚乙酸；NAA—萘乙酸；2,4-D---2,4-二氯苯氧乙酸

使用效價：

IAA<IBA<NAA<2,4-DNAA、IBA→生根培養(yǎng)

2,4-D→愈傷組織誘導與增殖（2）作用誘導愈傷組織和根分化，促進細胞分裂和伸長。NAA和IBA常與細胞分裂素結(jié)合用于芽的增殖。（3）濃度

0.05－5mg/L（4）配制生長素可溶解在稀NaOH中或溶于乙醇。第20頁,共62頁，2024年2月25日，星期天4.2細胞分裂素（CTK）（1）種類：Kt---激動素

BAP---芐氨基嘌呤

2－iP---異戊烯腺嘌呤

ZT-玉米素

TDZ（2）作用：啟動脫分化、細胞增殖，誘導愈傷組織芽分化、芽增殖，叢生芽。（3）濃度：0.05－10.0mg/L（4）配制：溶于稀酸或稀堿

第21頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

激素配比模式生長素與細胞分裂素：它們的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。

高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生長素細胞分裂素=如：為了促進芽器官的分化，應除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。第22頁,共62頁，2024年2月25日，星期天細胞分裂素與生長素對器官或愈傷組織的影響第23頁,共62頁，2024年2月25日，星期天NoBAPBAP0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAA0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNAA5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.Somecallus第24頁,共62頁，2024年2月25日，星期天4.3赤霉素（GAs）

（1）種類：GA3（2）作用：促莖伸長，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。注意：不耐熱；生理活性5－15d，時間太長有抑制作用。較生長素和細胞分裂素少用，可溶于水。ABA→因物種不同，能促進或抑制愈傷組織生長；第25頁,共62頁，2024年2月25日，星期天5瓊脂/培養(yǎng)體支持材料5.1.瓊脂(1)用量6－10g/L(2)種類瓊脂粉瓊脂條(3)作用固化作用注意：瓊脂使用有優(yōu)缺點；新買應試凝固力。不凝原因：①pH<5不凝；②長時間高壓滅菌；③長期存放，易變質(zhì)；④廠家不同，雜質(zhì)含量不同⑤配制時融解不充分，分裝不均勻；5.2.其它

玻璃纖維濾紙橋海綿、卡拉膠等第26頁,共62頁，2024年2月25日，星期天6輔助性物質(zhì)6.3抗生素6.2抗氧化物6.1活性炭第27頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

6.1活性炭1)作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進新梢增殖（濃度0.1-0.2%）；促進生根,根避光生長；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）；有利于胚胎培養(yǎng)。2)常用濃度：0.5－10g/L3)注意：活性炭具副作用。選擇吸附性差，導致營養(yǎng)損耗和pH↓，應適當調(diào)高營養(yǎng)物質(zhì)與激素水平，并加大Agar用量。第28頁,共62頁，2024年2月25日，星期天6.2抗生素用量：用量5~20mg/L注意：抗生素對組織生長有抑制作用，使用要慎重。

多數(shù)需過濾滅菌。作用：抑制內(nèi)生菌；種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素、利福平、卡那霉素等，第29頁,共62頁，2024年2月25日，星期天6.3抗氧化物2)用量：50－200mg/L，3)作用：防止氧化4)注意：可用抗氧化劑洗滌外植體傷口表面。1)常用抗氧化劑：半胱氨酸、VC第30頁,共62頁，2024年2月25日，星期天6.4其它成分：AgNO3：作用：吸附乙烯，促進莖芽分化，防玻璃化苗、早衰、落葉；只能短期培養(yǎng)，用量

1~10mg/L，需過濾滅菌第31頁,共62頁，2024年2月25日，星期天pH值在滅菌之前培養(yǎng)基的pH值一般都是調(diào)節(jié)到5.0-6.0。一般來說，當pH值高于6.0時培養(yǎng)基將會變硬；低于5.0時，瓊脂不能很好地凝固。pH值對不同植物的影響會有差異，如玉米胚乳愈傷組織在pH值7.0時鮮重增加最快，在pH值6.1時干重增長最快。第32頁,共62頁，2024年2月25日，星期天種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7

不同植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求不同(見表)第33頁,共62頁，2024年2月25日，星期天二、培養(yǎng)基的制備第34頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1水和藥品水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水或重蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。但研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第35頁,共62頁，2024年2月25日，星期天藥品：應選取等級較高的化學純（CP）或分析純(AR)；藥品的稱量一定要準確、正確，防止藥勺之間的交叉污染。第36頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.1母液（貯備液，stocksolution)配制的目的1）方便配置其他培養(yǎng)基；2）保證各物質(zhì)成分的準確性及配制時的快速移取3）便于低溫保藏。

2.2母液配制方法（1）單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。（2）混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液.2培養(yǎng)基母液的配制和保存第37頁,共62頁，2024年2月25日，星期天（3）一般原則：一般母液配成比所需濃度高10-1000倍。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等。其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和SO42-，Ca2+、Mg2+和PO43-

一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。母液配好后放冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。第38頁,共62頁，2024年2月25日，星期天（4）母液配制的藥品與器材1）藥品：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1mol/L的NaOH，1mol/L的HCl2）器材：各類天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標簽、冰箱等。第39頁,共62頁，2024年2月25日，星期天（5）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例）有機物母液鐵鹽母液無機大量母液無機微量母液激素母液第40頁,共62頁，2024年2月25日，星期天配制MS培養(yǎng)基時母液的計算第41頁,共62頁，2024年2月25日，星期天A無機大量母液(擴大10倍配1L)成分硝酸鉀

硝酸銨硫酸鎂

磷酸二氫鉀氯化鈣稱量工具托盤天平百分電子天平注意：無機大量母液中的各種物質(zhì)在混合過程中有些離子易產(chǎn)生沉淀，應使每種物質(zhì)先充分溶解，再進行混合，而且鈣鹽最后緩慢加入進去。第42頁,共62頁，2024年2月25日，星期天硼酸，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鋅，氯化鈷，鉬酸鈉，碘化鉀萬分電子天平B無機微量母液（擴大100倍配1000ml）稱量工具成分第43頁,共62頁，2024年2月25日，星期天C鐵鹽（擴大100倍1000ml）鐵鹽硫酸亞鐵，Na2-EDTA注意：鐵鹽選用硫酸亞鐵而不用硫酸鐵，是因為它溶解后易產(chǎn)生紅色的氫氧化鐵沉淀。在裝有800ml蒸餾水的燒杯中加入2粒氫氧化鈉。溶解后加入3.73gEDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至1000ml，置于冰箱中備用。第44頁,共62頁，2024年2月25日，星期天D有機物（擴大50倍500ml）有機物甘氨酸VB1VB6煙酸肌醇注意：有機物中的物質(zhì)均采用電子天平稱取。第45頁,共62頁，2024年2月25日，星期天E激素母液（常用的）生長素NAA，IBA，2,4-D，IAA細胞分裂素6-BA，KT，GA，ZT注意：這些激素配制時，一般配成0.2-1mg/ml，NAA、IBA、IAA一般可先用少量無水乙醇助溶。2,4-D也可用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶，細胞分裂素類一般先用少量0.1mol／L鹽酸溶解后，再加入溫水冷卻后定容。第46頁,共62頁，2024年2月25日，星期天(6)母液的保存1)裝瓶:將配制好的母液分別倒入瓶中，貼好標簽，在標簽上注明母液名稱，配制倍數(shù)，與配制日期。2）儲藏：母液配好后放人冰箱內(nèi)4℃低溫保存，用時再按比例稀釋。第47頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3培養(yǎng)基的配制1)用具器材：粗天平、塑料量杯、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、藥勺、pH試紙（5.4-9.0）/酸度計、橡皮吸球、吸水紙、羊皮紙等。2)藥品試劑：蒸餾水、蔗糖、瓊脂、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、各種培養(yǎng)基母液3.1實驗用品第48頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3.2培養(yǎng)基配制（以1L百合繼代培養(yǎng)基為例）

1)培養(yǎng)基配方：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%瓊脂2)配方成分計算：大量元素（擴大10倍配1L）微量元素（擴大100倍配1000ml）有機物（擴大50倍配500ml）鐵鹽（擴大100倍配1000ml）6-BA(0.5mg/ml)NAA(0.1mg/ml)蔗糖瓊脂100ml10ml10ml10ml3ml2ml30g8g第49頁,共62頁，2024年2月25日，星期天母液的稀釋計算吸取量=需要配制培養(yǎng)基的體積X需要配制濃度母液濃度第50頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3)配制步驟其他準備加瓊脂第51頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)常用培養(yǎng)基的配方及其特點1培養(yǎng)基的種類1.1根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基：是指加凝固劑（如瓊脂）的培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：是指不加凝固劑的培養(yǎng)基。

1.2根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程分為初代培養(yǎng)基：是指用來第一次接種從植物體上分離下來的外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：是指用來接種繼初代培養(yǎng)之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。第52頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.3根據(jù)其作用不同分為誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基1.4根據(jù)其營養(yǎng)水平不同分為基本培養(yǎng)基：主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等完全培養(yǎng)基：就是在基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它復雜有機附加物等。下面介紹幾種基本培養(yǎng)基:第53頁,共62頁，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆無機鹽、離子濃度高，含高K、N，硝酸鹽含量較高，含銨鹽?！魻I養(yǎng)豐富◆加速合作愈傷組織和培養(yǎng)物生長1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設計的。廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基第54頁,共62頁，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆無機元素用量是MS的1/3－1/2◆微量種類少◆無肌醇MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基第55頁,共62頁，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆無機鹽量較低◆使用廣泛◆適合生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)等提高了MgSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基White培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基第56頁,共62頁，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基◆含較低的銨，硝酸鹽和鹽酸硫胺素用量較高。◆適合雙子葉植物，尤其木本植物組培。1968年由Galmbo