基因組測序與序列組裝

關(guān)于基因組測序與序列組裝什么是基因組什么是基因DNA測序的方法DNA序列的組裝主要內(nèi)容:第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天1.什么是基因組

基因組就是一個物種中所有基因的整體組成?；蚪M有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系。第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天什么是C值？通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量.

在真核生物中，C值一般隨著生物的進(jìn)化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。

C值悖理：生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌真菌等動物陰影部分為一個門內(nèi)C-值的范圍第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天重復(fù)順序高度重復(fù)順序：長度：幾個~幾千個bp

拷貝數(shù)：幾百個~上百萬個首尾相連，串聯(lián)排列集中分布于染色體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等）也稱衛(wèi)星DNA中度重復(fù)順序：一般分散于整個基因組中；長度和拷貝數(shù)差別很大單一順序：基因主要位于單一順序動物中單一順序約占50％植物中單一順序約占20％第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天DNA的復(fù)性遵循二級反應(yīng)動力學(xué)，可表述為：dCt/dt=-KC02

反應(yīng)達(dá)t時，單鏈DNA濃度=CtC0=單鏈DNA起始濃度K＝復(fù)性速度常數(shù)順序復(fù)雜性第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天Cot(1/2)=1/K(mol.Sec/L)

常數(shù)

Ct/C0

0101C0t(1/2)C0t(1/2)

C0t(1/2)值與基因組復(fù)雜性成正比。第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。

基因分類：編碼RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等；編碼蛋白質(zhì)的基因2.什么是基因？第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天基因的不連續(xù)性Intron和Exon:大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因的編碼順序(Exon)都被或長或短的非編碼順序(Intron)隔開第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天基因家族

一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔(dān)負(fù)類似的生物學(xué)功能,可以相互補(bǔ)償,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天假基因(Pseudogene)來源于功能基因但已失去活性的DNA序列產(chǎn)生假基因的原因有:由重復(fù)產(chǎn)生的假基因;加工的假基因,由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再整合到基因組中;殘缺的基因(Truncatedgene)第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天假基因的產(chǎn)生途徑之一第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天重疊基因:同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白的信息.重迭基因有以下幾種情況：*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部*部分重疊*兩個基因共用少數(shù)堿基對第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部如：B和A，E和D

其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天*部分重疊如：K和C*兩個基因共用少數(shù)堿基對如：D和J-------TAATG-------D終止密碼子J起始密碼子第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.DNA測序的方法鏈終止法測序化學(xué)降解法測序自動化測序非常規(guī)DNA測序第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.1鏈終止法測序(thechainterminationmethod)

基本原理:

通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶

4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸

↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬?？寺NADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無5’→3′外切酶活性C無3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.2化學(xué)降解法測序基本原理:

在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)集團(tuán),再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解.第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)路線

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)堿基特異修飾方法GpH8.0,用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)法測序?qū)嵗哙さ?7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.3自動化測序基本原理與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)記黃色熒光,ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3.4非常規(guī)測序毛細(xì)管電泳

用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳,節(jié)省時間,加快測序進(jìn)程,其他程序同鏈終止法或化學(xué)測序法.

光點(diǎn)測序

脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA3’-末端時會釋放1個焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,并發(fā)出光亮.由此,往反應(yīng)液中每次只加入1種核苷酸,當(dāng)加入的核苷酸結(jié)合時,反應(yīng)液發(fā)出亮點(diǎn),并記錄核苷酸種類;當(dāng)核苷酸未結(jié)合時,反應(yīng)液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來測定DNA序列.第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天毛細(xì)管電泳儀第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天DNA芯片測序基本原理將各種排列順序的寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上,每個點(diǎn)播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號,然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天利用基因芯片進(jìn)行雜交測序的原理第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天4序列的組裝4.1隨機(jī)測序與序列組裝

隨機(jī)測序也稱”鳥槍法”.

序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.

優(yōu)點(diǎn):不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計算機(jī)拼裝第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天ABC小片段測序計算機(jī)拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP錯裝第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天實例:

流感嗜血桿菌基因組的測序及順序組裝超聲波打斷純化的基因組DNA↓瓊脂糖電泳收集1.6～2.0Kb的區(qū)段、純化↓構(gòu)建到質(zhì)粒載體中↓隨機(jī)挑選19687個克隆,進(jìn)行28643次測序,得到可讀順序為11631485bp↓組裝成140個覆蓋全基因組范圍的獨(dú)立的順序重疊群,↓第36頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

各重疊群間仍有間隙

順序間隙物理間隙載體或宿主菌選用不當(dāng)而被丟失的順序測序時遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫第37頁,共46頁，2024年2月25日，星期天4.2限制測序

限制測序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA順序進(jìn)行組裝.

一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測序中也采用這一方法.

如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據(jù)克隆重疊群,先進(jìn)行各個BAC克隆的隨機(jī)測序,再進(jìn)行序列組裝；

水稻基因組測序計劃采取得策略與此相同.第38頁,共46頁，2024年2月25日，星期天4.3指導(dǎo)測序與序列組裝

建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測序”。在人類基因組進(jìn)入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下:A構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序;B構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序,讀取2個端部順序;C參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點(diǎn),進(jìn)行序列組裝，排成重疊克隆群.第39頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

先將染色體打成比較大的片段(幾十~幾百Kb),利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝第40頁,共46頁，2024年2月25日，星期天兩種策略的比較鳥槍法策略指導(dǎo)測序策略不需背景信息構(gòu)建克隆群

(遺傳、物理圖譜)時間短需要幾年的時間需要大型計算機(jī)得到的是