人類細(xì)胞質(zhì)的提取等

關(guān)于人類細(xì)胞質(zhì)的提取等Contents1.人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取2.RT-PCR的原理、方法3.瓊脂凝膠電泳結(jié)果分析及應(yīng)用第2頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取

真核細(xì)胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。

第3頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取·分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況·獲得新基因AIMS·研究基因的拼接·分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物第4頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取原理：RNA的不穩(wěn)定性

由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性，從而達(dá)到成功提取RNA。第5頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取常用RNA酶抑制劑：

焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。

氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。第6頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取

RNA提取的一般步驟：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎組織加入β-巰基乙醇可以抑制RNA酶活性

分離RNA一般用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開

沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH=5.2）或異丙醇。

第7頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天人類細(xì)胞質(zhì)RNA的提取④洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時(shí)，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解⑤融解RNA一般使用TE（三羥甲基氨基甲烷和EDTA配置而成）⑥保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase（核糖核酸酶）的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存也應(yīng)該如此第8頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

RT-PCR

的原理及方法

RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。第9頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

RT-PCR

的原理及方法

背景

基因的表達(dá)

＊不同細(xì)胞或組織表達(dá)不同的基因基因組DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白質(zhì)產(chǎn)物第10頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天RT-PCR

的原理及方法目的通過反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription，RT)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)的方法，檢測(cè)目的基因在特定組織或細(xì)胞中、mRNA水平的表達(dá)豐度第11頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天RT-PCR

的原理及方法原理及方法mRNA

(messengerRNA)cDNA(complementaryDNA)

PCR產(chǎn)物RT(反轉(zhuǎn)錄)

PCR(聚合酶鏈反應(yīng))第12頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天RT-PCR

的原理及方法第13頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天Diagram第14頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。第15頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳TEXTTEXTTEXTTEXT原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動(dòng)率才與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測(cè)定RNA分子量時(shí)，一定要用變性凝膠。在需快速檢測(cè)所提總RNA樣品完整性時(shí)，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可第16頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳檢測(cè)

在基因組DNA的提取中，用蒸餾水溶解提取出的DNA，在1.0%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳，以Marker(分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))作為參照，用≤5V/cm的電泳30-60分鐘，最后采用EB溶液進(jìn)行染色后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察拍照。第17頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠電泳

應(yīng)用（廣泛應(yīng)用與分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)）分離提取大分子DNA可區(qū)分相差100bp的DNA片段測(cè)定糖化血紅蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)免疫擴(kuò)散法利用瓊脂糖凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)，使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物第18頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天