口蹄疫免疫抗體檢測經(jīng)典方法詳述

液相阻斷ELISA實驗原理液相阻斷ELISA實驗原理是抗原抗體在液相中反應(yīng)，病毒抗原與稀釋好的被檢血清首先在液相中反應(yīng)，然后抗原抗體復(fù)合物和沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫特異性抗體的ELISA板中，沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被ELISA板中的抗體捕獲，再通過酶結(jié)合物與底物顯色10～15min，最后加入終止液進(jìn)行讀數(shù)?？贵w滴度以阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示。液相阻斷ELISA特點(diǎn)1、優(yōu)勢口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測方法專為檢測FMD全病毒抗體設(shè)計，是針對完整病毒粒子的抗原位點(diǎn)進(jìn)行抗體定性定量檢測，通過對被檢血清的倍比稀釋，定量測定血清中抗體含量的高低。液相阻斷ELISA與中和試驗的原理相似，又被稱為體外病毒中和試驗，克服了病毒中和試驗無法在臨床檢測中推廣應(yīng)用的缺點(diǎn)，適用于大批量樣品的血清學(xué)調(diào)查。同時，口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測技術(shù)具有良好的敏感性、可重復(fù)性，與攻毒保護(hù)有很好的相關(guān)性，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于口蹄疫免疫抗體水平的監(jiān)測。2、劣勢液相阻斷ELISA操作步驟較多，耗時較長，對實驗檢測人員技術(shù)性、熟練性和操作性要求較高。液相阻斷ELISA的操作細(xì)節(jié)及注意事項1、樣品的保存及使用全血樣品采集后應(yīng)盡快分離血清避免溶血，500～4000rpm離心5～10min；若無離心條件，可將全血樣品在室溫下(20℃)傾斜放置2~4小時(依室溫而定)，或4~8℃環(huán)境中過夜待其自然凝固，然后轉(zhuǎn)移上清液于新管待測。血清0～4℃條件下可保存5d，如采用－15～－20℃冷凍保存時間更長。冷凍保存血清樣品需在4～8℃條件下解凍，再平衡至室溫，稀釋前需充分混勻。2、試劑的回溫及孵育（1）試劑回溫試劑盒中的試劑，包括包被用的反應(yīng)板，在使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，將其提前拿出放置1～2h平衡至室溫（20～25℃），冬季可置于25℃左右的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)回溫。（2）加樣孵育每次加樣后反應(yīng)板必須用封板膜封嚴(yán)，否則會造成水分過多蒸發(fā)，影響實驗結(jié)果；反應(yīng)板盡量均勻放置于孵育箱，不可重疊放置，以免傳熱不均勻。在孵育時，實驗操作者一般習(xí)慣將ELISA板放入溫箱即開始計時，沒有考慮ELISA板孔內(nèi)溫度升至37℃尚需一定的時間，這樣容易造成實際測定中溫育時間不夠，因此實驗時需根據(jù)具體室溫情況可適當(dāng)增加ELISA板在溫箱中的孵育時間。3、不同批次試劑盒的使用不同批次試劑盒中的每種試劑成分都被優(yōu)化和作為一個整體工作，為了使實驗結(jié)果準(zhǔn)確，避免使用不同批次的試劑成分，尤其是病毒抗原，不同批病毒抗原的工作濃度不同，因此不能隨意亂用，要對應(yīng)于相同批次試劑盒中的各種成分使用，同時要避免反復(fù)凍融病毒抗原，可將其先進(jìn)行小體積封裝-20℃保存（-40℃保存效果更好），每次實驗時按需取封裝抗原。4、試劑的配制配制試劑前后都要充分混勻，濃縮的PBST液在低溫下會有無機(jī)鹽結(jié)晶析出，使用前可水浴或恒溫培養(yǎng)箱融化，用無離子水或超純水做25倍稀釋。底物溶液按操作說明配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。5、血清的稀釋、加樣、轉(zhuǎn)移、洗滌及拍板（1）血清的稀釋：稀釋待檢血清時先加稀釋液，然后加待檢樣品。（2）加樣：加樣時要將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，同時輕輕晃動均勻，不能出現(xiàn)氣泡，否則一些弱陽性的樣品容易出現(xiàn)假陰性；加樣不宜太快，不可濺出；每次加樣都要保持同樣的順序，板數(shù)多者要單獨(dú)計時，保證每板反應(yīng)時間充足。（3）移板：將抗原抗體混合液從反應(yīng)板轉(zhuǎn)移至ELISA板上，目的是將反應(yīng)板中的抗原抗體復(fù)合物和沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原轉(zhuǎn)移到包被了口蹄疫O型或A型特異性抗體的ELISA板中，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的免疫反應(yīng)及酶促反應(yīng)。轉(zhuǎn)移時，按順序轉(zhuǎn)移，避免出錯，同時及時更換槍頭。（4）洗滌：洗滌是ELISA操作中的關(guān)鍵技術(shù)之一，每孔加入洗滌液300ul，洗滌3~5次，同時每次洗滌的時間一般為30s。洗板時需保證酶標(biāo)板平放，將洗滌液注滿各孔，避免漏液、溢液現(xiàn)象。

（5）拍板：拍板時避免手指接觸板底，同時應(yīng)注意觀察板孔內(nèi)有無氣泡附著，如有氣泡，則需在加樣前一一去除。6、試驗顯色、終止、讀數(shù)（1）顯色：顯色是ELISA操作中的最后一個反應(yīng)步驟，是酶催化無色底物，生成有色產(chǎn)物的過程。反應(yīng)溫度和時間是影響顯色的因素。因此，加入底物后的反應(yīng)溫度應(yīng)嚴(yán)格按實驗操作說明書執(zhí)行。根據(jù)底物顯色情況，反應(yīng)時間可適當(dāng)調(diào)整為10～15min。（2）試驗終止：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)盡快加入終止液。（3）OD值讀數(shù)：讀數(shù)前應(yīng)先將酶標(biāo)儀預(yù)熱半小時，讀數(shù)時應(yīng)注意微孔板底部潔凈無污染，如有水分應(yīng)仔細(xì)擦干，同時定期清洗酶標(biāo)儀濾光片。不同口蹄疫抗體檢測試劑盒結(jié)果差異分析

目前除了液相阻斷ELISA試劑盒外，市場在售口蹄疫抗體檢測試劑盒種類較多，其他大部分試劑盒僅包被結(jié)構(gòu)蛋白VP1的部分片段；若僅包被VP1，導(dǎo)致毒株特異性強(qiáng)，而同一血清型不同譜系毒株VP1序列差異大，所以檢測結(jié)果常常出現(xiàn)偏頗。而液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒包被全病毒抗原，對同一血清型不同譜系毒株差異小，檢測結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確。

總結(jié)

口蹄疫滅活疫苗屬于生物制品，當(dāng)疫苗注入機(jī)體后會發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，所以口蹄疫疫苗質(zhì)量評價必須要科學(xué)全面，才能綜合判斷疫苗的免疫效力。抗體檢測是目前評價口蹄疫疫苗免疫效果的重