《蛋白質(zhì)印跡》幻燈片

《蛋白質(zhì)印跡》幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除，謝謝！概論印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜〔NC膜〕上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法(southernblot)。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)展印跡分析。Northernblot:對(duì)RNA的印跡分析Westernblot:對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析Easternblot:對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析概論Westernblot：把電泳別離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定膜上，并用抗原抗體反響進(jìn)展特異性檢測(cè)的過程。是集電泳、轉(zhuǎn)印和免疫標(biāo)記為一體的蛋白質(zhì)別離檢測(cè)技術(shù),結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至1～5ng〔最低可到10－100pg〕的靶蛋白。Westernblot是檢測(cè)蛋白質(zhì)混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作為確定目的蛋白在不同細(xì)胞或同種細(xì)胞在不同條件下的相對(duì)含量的半定量方法Westernblot測(cè)定的不是蛋白的絕對(duì)含量，只是目的蛋白的相對(duì)含量：目的蛋白的存在與否特定實(shí)驗(yàn)條件下目的蛋白表達(dá)量的變化多種因素影響信號(hào)的強(qiáng)弱受，一般僅作為半定量指標(biāo)不同目的蛋白由于所用檢測(cè)的抗體不同，其含量不具有可比性WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS電泳轉(zhuǎn)膜鑒定膜上特定蛋白封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色WesternblottingIsolationIdentification1.蛋白樣品提?。嚎傮w原那么

1〕提取時(shí)盡可能只集中于提取目的蛋白。通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品2〕保持蛋白的處于溶解狀態(tài)通過裂解液的PH鹽濃度外表活性劑、復(fù)原劑等的選擇3〕提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，低溫操作，參加適宜的蛋白酶和磷酸酶抑制劑4〕盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子通過參加核酸酶或采取不同提取策略5〕樣品分裝，長期于-80℃中保存，防止反復(fù)凍融。一、蛋白質(zhì)的樣品制備通過稀釋使不同樣品具有一樣濃度，必要時(shí)需要對(duì)蛋白進(jìn)展?jié)饪s。常用的蛋白濃度測(cè)定方法包括：Bradford法，Lowry法，BCA法2.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法原理靈敏性干擾因素應(yīng)用Lowry法Folin－酚試劑法蛋白質(zhì)在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，還原酚磷鉬酸產(chǎn)生藍(lán)色化合物，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系較高（約5μg/ml）

適用于脂類含量較高的樣品測(cè)定，也能耐受相當(dāng)濃度的去垢劑如SDS。受硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇干擾耗費(fèi)時(shí)間長40～60分鐘；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化;標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式，專一性較差Bradford法考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色，在波長595nm吸收峰，在一定的范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量呈線性關(guān)系高（約1～5μg/ml）,易受強(qiáng)堿性緩沖液，TritonX-100，SDS等去污劑的影響快速5～15分鐘，顏色穩(wěn)定；深淺隨不同蛋白質(zhì)變化;標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性BCA法BCA法基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2+還原

成Cu+，BCA螯合Cu1+

作為顯色劑，產(chǎn)生蘭紫色并在562nm有吸收峰很高（0.5-20μg/ml）不易受一般濃度去污劑的干擾可受螯合劑、略高濃度的還原劑的影響較快40分鐘內(nèi)，抗干擾能力強(qiáng)SDS電泳，是在PAGE系統(tǒng)中引進(jìn)SDS〔十二烷基硫酸鈉〕，SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)造，而電泳系統(tǒng)中存在的強(qiáng)復(fù)原劑〔DTT或β-巰基乙醇〕能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的棒狀構(gòu)造的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，降低或消除了不同蛋白質(zhì)分子間天然的電荷和分子形狀的差異，蛋白質(zhì)在電泳時(shí)的遷移速度僅取決于其分子大小。二.SDS電泳當(dāng)SDS單體濃度>1mm時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì))，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物當(dāng)分子量在15～200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：

logMW=K-bX式中：MW:分子量X:遷移率k、b:常數(shù)電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)SDS－PAGE電泳消除了原攜帶電荷的差別，遷移僅與分子量有關(guān)除了電荷作用，同時(shí)具有分子篩作用丙烯酰胺(Arc)和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)

SDS配膠的Tris緩沖液TEMEDAP(時(shí)間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份以溫?zé)?利于溶解)的去離子水配制含有29%(w/v)Arc和1%(w/v)Bis儲(chǔ)存液,儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。Mini系列是8.6x6.8cmBio-RedMini電泳裝置SDS－PAGE電泳分離只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的正確選擇尤為重要。不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同濃度的凝膠濃度。濃度太大，孔徑太小，電泳時(shí)樣品分子不能進(jìn)入凝膠。濃度太小，孔徑太大，則樣品中各種蛋白分子均隨著緩沖液流向前推進(jìn)而不能得以很好地分離。

凝膠濃度的選擇PAGE膠的孔徑隨

“Bis～Arc〞

比率的增加而變小，比率接近

1：20

時(shí)孔徑到達(dá)最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“Bis～Arc〞

為1：29

配制，研究說明它能別離分子量大小相差只有3%

的蛋白質(zhì)。凝膠濃度與蛋白別離范圍對(duì)于具有不同遷移率的多組分樣品，很難選擇一種濃度的凝膠來分離，此時(shí)最好使用梯度膠。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200一般來說，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用。最常見的凝膠電泳緩沖液由Tris-甘氨酸或

Tris-tricine組成。

分離很寬分子量范圍（6-200KD）的蛋白質(zhì)適于分離小分子蛋白質(zhì)（10KD）電泳緩沖系統(tǒng)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

(marker)

未染色marker

是最簡單,最準(zhǔn)確的marker。由于沒有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小。

現(xiàn)在的Marker多數(shù)都選用預(yù)混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。

預(yù)混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，以方便辨認(rèn)寬分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

預(yù)染蛋白分子量是純化好的蛋白混合物，與染料共價(jià)耦聯(lián)。優(yōu)點(diǎn)：及時(shí)監(jiān)測(cè)電泳情況和估計(jì)遷移率直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜效率可以在膜上標(biāo)記蛋白分子量缺點(diǎn)：預(yù)染Marker與染料共價(jià)耦聯(lián)，電泳時(shí)遷移特性可能會(huì)發(fā)生改變，不適合精確定位蛋白通常預(yù)染marker的條帶和目標(biāo)蛋白不完全一樣，只是參考大小，在不需要區(qū)分大小相近的條帶時(shí)，預(yù)染Marker很方便實(shí)用。預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以分為兩種：單色預(yù)染和多色預(yù)染注意：由于轉(zhuǎn)膜是一個(gè)將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上，所以需要的marker上樣量相對(duì)較少，但要在電泳過程中看到預(yù)染Marker，常需要比說明書里多加一些Marker。

優(yōu)點(diǎn)：1.包裝方便攜帶和使用常溫儲(chǔ)存在48孔板中，使用不需解凍，只需用槍頭刺穿外層薄片，將槍頭中的10ul去離子水注入Marker干粉中吸起來就可使用2.獨(dú)立包裝可以防止污染3.分子量范圍較廣，從18.5kD到215kD〔4-20%SDS〕4.凝膠上和轉(zhuǎn)移膜上各條帶分布水平和顯色水平一致5.可用于染色〔考馬斯亮藍(lán)染色和銀染〕。BlueRangerPrestainedProteinMWMMix（Pierce產(chǎn)品）：110元／次單色預(yù)染的極品內(nèi)參照（Loadingcontrols）電泳步驟1.試劑準(zhǔn)備

需要注意的事項(xiàng)：Arc和Bis的有效性

AP的有效性2.玻璃板的準(zhǔn)備

制膠架注意滲漏3.配膠和灌膠積層膠和分離膠梳子及其選擇凝膠濃度的選擇：根據(jù)目的蛋白的分子量要考慮的因素：溫度需要注意的事項(xiàng)：過硫酸胺最后加氣泡別離膠不要灌得太滿。gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好?；旌蠑嚢杷俣纫m當(dāng)，太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形；太慢不均勻。注意事項(xiàng)4.樣品準(zhǔn)備和點(diǎn)樣

樣品按1:1加入2xSDS加樣緩沖液，煮沸3-5min。注意水蒸氣的小問題分子量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參陽性對(duì)照5.電泳

積層膠：低電壓分離膠：高電壓注意電泳時(shí)間，當(dāng)溴酚藍(lán)指示到凝膠盡頭時(shí)停止。

注意正負(fù)極影響電泳效果的因素：1.電壓低電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮。2.膠的均勻度膠越均勻，條帶越窄，別離越均勻。︶條帶呈笑臉狀凝膠冷卻不均勻，中間冷卻不好︵條帶呈皺眉狀可能凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，兩邊聚合不完全拖尾樣品溶解不好紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜條帶兩邊擴(kuò)散加樣量過多電泳中出現(xiàn)的現(xiàn)象及原因

電泳結(jié)果檢查：考馬斯亮藍(lán)染色：使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染：操作復(fù)雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。以上兩種染色方法染料與蛋白不可逆結(jié)合，干擾后面的WesternBlot實(shí)驗(yàn)，可選擇同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。

三、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)轉(zhuǎn)膜方法選擇原那么：a.膜與目的蛋白的結(jié)合能力〔單位面積的膜結(jié)合蛋白的載量〕以及膜的孔徑〔攔截蛋白的大小〕；b.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)〔適和用于所選的顯色方法，信噪比好〕；c.根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜，如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析。

轉(zhuǎn)印膜常用的固定化膜：NC膜（硝酸纖維素膜）和PVDF膜。1.

蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力〔80－100ug/cm2)。2.適用于各種顯色方法，同位素，化學(xué)發(fā)光〔Luminol類〕、常規(guī)顯色、熒光顯色；3.背景低，信噪比高。4.轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在適宜的條件下可以穩(wěn)定保存很長時(shí)間。Schleicher&Schull公司的實(shí)驗(yàn)說明，轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白4℃條件下保存5年依然保持免疫識(shí)別特性，可以得到清晰可信的WesternBlot結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)

硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜)

純的硝纖膜較脆，易卷，不適合用于需要屢次重復(fù)清洗的用途缺點(diǎn)注意1.硝纖膜孔徑選擇：>20KD蛋白：選擇0.45um孔徑的膜，<20KD蛋白：選擇0.2um的，<

7KD蛋白：選擇0.1um的膜。2.選擇純的NC膜（混有含醋酸纖維（CM）的NC膜結(jié)合力會(huì)降低）。3.選擇合適的去垢劑：NC膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)槟承┤ノ蹌┒淮?，因此在封閉時(shí)最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%

常見生產(chǎn)公司：Schleicher&SchullMilliporePALL羅氏InvitrogenGE〔Amersham〕SantaCruz均有NC產(chǎn)品Schleicher&Schull是第一個(gè)提供硝纖膜的廠家，其NC膜分為純NC膜和強(qiáng)化NC膜兩種：

ProtranNC膜OptitranNC膜Protran特點(diǎn)：100%PureNC，蛋白結(jié)合能力強(qiáng)低背景、多孔徑選擇（0.45,0.2,0.1um）保存時(shí)間長（實(shí)驗(yàn)證明膜上蛋白辨認(rèn)時(shí)間可長達(dá)5年）純NC膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需小心操作Schleicher&Schull”“王牌“產(chǎn)品——純NC膜

Optitran：在超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素，外表和純NC膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點(diǎn)，內(nèi)部多了中性支持物，其柔韌度和機(jī)械耐受力高于NC膜，不容易卷曲，特別適于重復(fù)標(biāo)記和洗脫的實(shí)驗(yàn)。蛋白結(jié)合力不如純NC膜結(jié)合能力強(qiáng)(75-90μg/cm2)

。Schleicher&Schull的強(qiáng)化NC膜PVDF膜

做WB的“殺手锏PVDF:聚偏二氟乙烯膜,作為基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由Millipore公司在1985年首先推出。PVDF膜的蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性都強(qiáng)于NC膜。PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2，而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比NC膜高6倍！PVDF膜特點(diǎn)：

1.更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性。

2.適用多種檢測(cè)方法：化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都可以，但不適合熒光。3.膜孔徑有0.45um和0.2um，后者對(duì)小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會(huì)比前者稍高。PVDF膜需要100%甲醇預(yù)處理（不超過15秒）MiliporePVDF:20*20cm(2400元/10張)BioRedNC膜：30cm*3.5m（2200元/卷）活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分為：Immobile-P〔0.45um〕：孔徑均一，蛋白吸附力強(qiáng)，染色性能好、抗溶劑能力強(qiáng)和信噪比高。Immobilon-PSQ(0.2um)：是印跡小分子蛋白質(zhì)〔<20KDa〕的理想選擇——優(yōu)良的蛋白質(zhì)吸附性能，滲漏少。Immobilon-FL(用于熒光顯色)第一個(gè)專門為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。BlottingSandwichesforHighTroughput四種。

這幾種膜最大特點(diǎn)——快。按照Millipore的操作手冊(cè)，Immobilon可以在保證質(zhì)量的前提下縮短WB時(shí)間到2個(gè)小時(shí)——主要是縮短封閉和洗脫時(shí)間。

尼龍膜更多是用于核酸的轉(zhuǎn)移，也有見于蛋白印跡，比方dotblot優(yōu)點(diǎn)〔相對(duì)NC膜〕1.結(jié)合力強(qiáng)，2.機(jī)械強(qiáng)度大，結(jié)實(shí)，柔軟且不易卷曲，便于操作缺點(diǎn)：1.背景高——由于尼龍膜電荷密度高，使得非結(jié)合區(qū)的封閉比疏水性NC膜困難，對(duì)于靈敏度高的檢測(cè)方法，背景問題尤為突出2.當(dāng)轉(zhuǎn)移緩沖液中存在有SDS時(shí)蛋白質(zhì)容易從尼龍膜上泄漏〔通過甲醛固定可以緩解這一情況〕。3.無適合尼龍膜上的直接染色方法。目前WB實(shí)驗(yàn)多不選擇尼龍膜。

尼龍膜轉(zhuǎn)移緩沖液緩沖液的組成對(duì)蛋白與膜和探針的結(jié)合起著決定的作用。

為了得到最有效的轉(zhuǎn)移，不但必須有足夠的時(shí)間，緩沖液的pH和離子強(qiáng)度還必須使蛋白質(zhì)有最大的可溶性和轉(zhuǎn)移速度。

目前通常使用Tris-甘氨酸緩沖液。

若轉(zhuǎn)膜后有樣品要測(cè)序，最好用CAPS緩沖液，減少甘氨酸對(duì)測(cè)序的污染。TransferBuffer:48mMTrisbase5.81g39mMGlycine2.93g0.037%SDS0.375g20%MeOH200mltotal1000mlNotes1.全程手套操作，防止手印污染也保護(hù)自己2.做好標(biāo)記，以免轉(zhuǎn)摸后分不清條帶泳動(dòng)方向及加樣孔順序。3.對(duì)于特別小的蛋白，tricine(兩性離子緩沖劑)SDS電泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD間的分辨率。4.轉(zhuǎn)膜前膠要在轉(zhuǎn)移緩沖液里平衡一下防止膠變形，有助于進(jìn)一步去掉可能有礙轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。5.讓電轉(zhuǎn)液從下通過膜以趕走膜內(nèi)空氣，膜需要徹底浸潤否那么影響轉(zhuǎn)膜效果。6.膜不要用考馬斯亮藍(lán)或者氨基黑染色,可以用麗春紅S染色.

可逆染液：ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等染色后，染液可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析

不可逆染液：

考馬斯亮蘭、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)免疫學(xué)基礎(chǔ)抗原抗體反應(yīng)抗體起到探針的作用，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。多克隆抗體單克隆抗體信號(hào)強(qiáng)度較好視不同抗體而異特異性良好，但有一定的背景最佳，但有交叉反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)多數(shù)能識(shí)別變性抗原特異性好缺點(diǎn)不易重復(fù)，有時(shí)背景較深多數(shù)不能識(shí)別變性抗原四、免疫檢測(cè)同位素標(biāo)記生物素標(biāo)記地高辛標(biāo)記酶標(biāo)記

酶標(biāo)底物：生色底物化學(xué)發(fā)光法底物熒光底物抗體標(biāo)記方法酶標(biāo)記法安全且快速，已經(jīng)成為WesternBlot的主流檢測(cè)方法。酶促反響的底物不同顯色方法不同：化學(xué)發(fā)光Chemiluminescent：靈敏度很高，靈敏度已經(jīng)到達(dá)pg級(jí)別，甚至還有Femto級(jí)別的，靈敏度超過了同位素底物顯色Colormetirc/Chromogen：直接顯色而操作簡便且本錢低。主要有：辣根過氧化物酶HRP〔HorseradishPeroxidase)堿性磷酸酶AP〔AlkalinePhosphatase〕

葡萄糖氧化酶〔GlucoseOxidase〕β-半乳糖苷酶〔β-Galactosidase〕少見常見酶標(biāo)記法生色底物檢測(cè)

HRP的顯色底物有：

DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride,3’3’二氨基聯(lián)苯胺)

4-CN(4-Chloro-1-naphthol,4-氯-1-萘酚)CN/DAB

AEC(3-amino-9-ethylcarbazole,3-氨基-乙基咔唑)，

TMB(3.3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,3.3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺)

辣根過氧化物酶（HRP）底物顯色是利用底物在HRP和H2O2存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累這一過程檢測(cè)WB的結(jié)果。

HRP底物DAB4-CNAECTMB分子量214.14178.58210.28240.4穩(wěn)定性好一般避光好靈敏度250pg1ng

100pg背景

一般低高高終產(chǎn)物成像性

不能很好的成像容易成像容易成像顏色褐色介于藍(lán)色與藍(lán)紫色之間（可用于double-staining）紅色藍(lán)紫色毒性有（疑有治癌作用）無有無ACE各方面性質(zhì)與DAB相似，但靈敏度要比DAB稍差信噪比高，成分安全，特別合適于靈敏度要求高的WB，但由于靈敏度高而易引起高背景，以相應(yīng)的延長封閉的時(shí)間和注意洗滌的次數(shù)DAB顯色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的廠家推出DAB+4-CN混合底物，結(jié)合了DAB靈敏度高和4-CN背景低，易成像的優(yōu)點(diǎn)，能獲得很好的黑色沉淀成像。用金屬離子增強(qiáng)信號(hào)的DBA顯色試劑靈敏度可以高達(dá)20pg。AP——堿性磷酸酶堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法AP可將無色的底物BICP（5－溴－4－氯－吲哚磷酸鹽）轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色產(chǎn)物AP很早就被用于檢測(cè)系統(tǒng)——包括WB檢測(cè)和核酸檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高底物更穩(wěn)定〔試劑盒保存時(shí)間長〕缺點(diǎn)：顯色背景偏高〔脫脂奶粉和BSA中富含AP〕。分子克隆III推薦的適用AP封閉劑是：6%的酪蛋白1%聚乙烯吡咯烷酮10mmolEDTA

65度加熱1小時(shí)確保AP失活后再用于封閉。BCIPNBTBCIP/NBTBCIP/INT學(xué)名,5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphatetoluidinesalt四氮唑藍(lán)nitro-bluetetrazoliumchloride碘硝基四唑紫Iodonitrotetrazolium作用與O2反應(yīng)形成沉淀氧化反應(yīng)BCIP用NBT作為電子受體氧化反應(yīng)靈敏度100pg100pg30pg一般沉淀顏色紫色藍(lán)紫色藍(lán)紫色棕紅色用途AP顯色AP或者葡糖氧化酶AP，原位雜交和免疫組化AP和免疫組化AP顯色底物AP顯色的靈敏度就可以達(dá)到低pg級(jí)，但封閉要做得好BCIP/NBT靈敏度最高，顯色也比較銳利，成像性比較好，最常用到

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光法是目前使用最為廣泛，平安好且靈敏度極高的WB檢測(cè)方法。該方法在酶和底物都存在時(shí)才發(fā)光，不同于生色反響形成不溶的產(chǎn)物累積于膜上，所以特別適合同一張膜對(duì)不同的目標(biāo)蛋白分別進(jìn)展屢次檢經(jīng)常使用的顯色交聯(lián)酶：HRP和AP抗體濃度過高造成高背景——所以抗體用量的稀釋倍數(shù)要大HRP化學(xué)發(fā)光底物經(jīng)典底物：Luminol辣根過氧化物酶-ECL法:

利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（魯米諾）,生成一種不穩(wěn)定的中間物質(zhì),其衰變時(shí)在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶,在化學(xué)增強(qiáng)劑存在的情況下，光強(qiáng)度可增強(qiáng)1000倍。利用X線膠片感光原理,將結(jié)果記錄下來ECLECLPlusECLAdvanceRecommendedapplicationsRoutineWesternblottingHighsensitivityWesternblottingandchemifluorescentdetectiononscannersHighestsensitivityWesternblottingprimaryantibodyand/ortargetisverylowabundanceSensitivityUpto10-12gUpto20timesgreaterthanECLUpto10timesgreaterthanECLPlusAntibodyeconomyGoodVeryGoodOutstandingPrimaryantibodyUpto1:10000Upto1:20000Upto1:100000SecondaryantibodyUpto1:15000Upto1:200000Upto1:500000BlockingAgentincludedCertainsystemsCertainsystemsYes-ECLAdvanceBlockSimplereprobingprotocolsYesYesYesEmissionduration1-2h24-18h4-6hGEHealthcare公司的ECL新產(chǎn)品

AP在催化脫磷底物方法時(shí)轉(zhuǎn)換數(shù)高,可快速產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào),獲得極高靈敏度的WB結(jié)果。WesternBreeze化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒〔Invitrogen公司產(chǎn)品〕〔1〕檢測(cè)靈敏度到達(dá)Femto水平〔2〕發(fā)光持續(xù)時(shí)間長達(dá)5天?！?〕兼容成像系統(tǒng)，〔4〕優(yōu)化后背景極低，Lumi-PhosWb化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒〔Pierce公司產(chǎn)品〕〔1〕靈敏度可以到達(dá)低pg級(jí)——1～2pg〔2〕檢測(cè)方法適用的膜還包括尼龍膜——這是許多化學(xué)發(fā)光底物所不兼容的〔3〕發(fā)光持續(xù)時(shí)間是8個(gè)小時(shí)〔2小時(shí)內(nèi)光最強(qiáng)〕AP化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)步驟1.封閉5%脫脂奶粉（溶于TBS緩沖液）

目的：封閉膜上未結(jié)合蛋白的位點(diǎn)Note：脫脂奶是最常用的經(jīng)濟(jì)配方，但其可能有痕量的生物素和AP，可造成背景污染而不適合生物素—親和素的檢測(cè)方法

采用AP檢測(cè)系統(tǒng),脫脂奶不適合用做封閉液。若用HRP檢測(cè)系統(tǒng)則封閉液不要加NaN3，它對(duì)HRP有滅活作用，選用AP作為顯色方法，封閉時(shí)要選擇Tris緩沖體系，不要用PBS封閉時(shí)間和封閉劑的量都要足夠。2.一抗溫育5%脫脂奶粉+適量一抗平緩搖動(dòng)溫度時(shí)間目的：一抗和目的蛋白結(jié)合3.洗膜

用含TWEEN-20的TBS緩沖液洗少量多次

目的：洗去未與目的蛋白結(jié)合的一抗4.二抗溫育

5%脫脂奶粉+適量二抗平緩搖動(dòng)溫度時(shí)間

目的：二抗和已與目的蛋白結(jié)合的一抗結(jié)合起放大作用5.洗膜

用含TWEEN-20的TBS緩沖液洗少量多次

目的：洗去未與一抗結(jié)合的二抗6.檢測(cè)：

辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)

8.灰度分析

灰度分析軟件MetaMorphoffline分析軟件；PhoretixD6.01，PDQuest7.3.1

目的：得到目的蛋白質(zhì)的相對(duì)含量WesternBlot常見問題分析實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題1.沒有注明可以用來做westernblot的一抗，可以用來做westernblot嗎？不一定