電子顯微鏡成像原理及應(yīng)用

電子顯微鏡成像原理及應(yīng)用

電子顯微鏡（ElectronMicroscope,EM)簡稱電鏡，它以電子束代替可見光的大型高分辨的顯微裝置。目前電鏡已廣泛應(yīng)用于包括醫(yī)學在內(nèi)的各個領(lǐng)域。

EM

在光學顯微鏡基礎(chǔ)上使細胞學的概念更加完善，對疾病的認識,特別是對發(fā)病機理的研究做出了巨大貢獻,為人類認識自我發(fā)揮了重要作用。分辨率與放大倍數(shù)分辨率：將鄰近兩點清晰區(qū)分、辨認的能力，用能被辨認的鄰近兩點的距離δ表示。δ越小，能分清的物體細節(jié)越細，分辨本領(lǐng)就越高。

δ=0.61λ/nSinαλ:電磁輻射波長，α:入射錐角；n:物體所處媒介的折射率；放大倍數(shù)：放大倍數(shù)與分辨本領(lǐng)存在著以下關(guān)系：M=δ眼/δ鏡

LM：可見光的平均波長為500nm，極限分辨率為0.25um.EM：電子波波長短，且波長隨加速電壓的增高而更短，當加速電壓為50～100千伏時，電子束波長約為0.0053～0.0037納米。由于電子束的波長遠遠小于可見光的波長，所以電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)遠遠優(yōu)于光學顯微鏡。目前較好的電鏡分辨率為0.2nm左右，比LM提高1000倍，比人眼提高100萬倍。

1、電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡

光學顯微鏡

光源 電子束 光束 分辨率約

0.2nm約

0.2μm介質(zhì)真空 空氣 透鏡 電磁透鏡 玻璃透鏡 聚焦電聚焦 機械 顯像方式熒光屏直接觀察放大倍數(shù)

1,000,000倍1,000倍成像原理利用樣品對電子的散射利用樣品對光的吸和透射形成明暗反差收和散射成明暗反差和顏色變化成像

間接、黑白直接、彩色透射電鏡TEM透射電鏡基本構(gòu)造與光學顯微鏡相似，只是用電子束代替光束，用磁透鏡代替玻璃透鏡。光源由電子槍和一或兩個聚光鏡組成，其作用是得到具有確定能量的高亮度的聚焦電子束。透射電鏡的基本結(jié)構(gòu)透射電鏡的總體工作原理是：由電子槍發(fā)射出來的電子束，在真空通道中通過聚光鏡將之會聚成一束尖細、明亮而又均勻的光斑，照射在樣品室內(nèi)的樣品上；樣品內(nèi)致密處透過的電子量少，稀疏處透過的電子量多，即：透過樣品后的電子束攜帶有樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息；經(jīng)過物鏡的會聚調(diào)焦和初級放大后，電子束進入下級的中間透鏡進行綜合放大成像，最終被放大了的電子影像投射在觀察室內(nèi)的熒光屏板上；熒光屏將電子影像轉(zhuǎn)化為可見光影像以供使用者觀察。廈門大學分析測試中心：高分辨率TecnaiF30

場發(fā)射透射電子顯微鏡系統(tǒng)（荷蘭Philips-FEI公司）廈門大學分析測試中心：日本電子公司JEM100CX-Ⅱ透射電鏡。

透射電子顯微鏡技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用

常規(guī)技術(shù)-----超薄切片制備生物樣品技術(shù)：由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。常規(guī)染色----為了增強細胞結(jié)構(gòu)的電子反差。染色是依據(jù)各種細胞結(jié)構(gòu)與染色劑（重金屬鹽）結(jié)合的選擇性，而形成對電子不同的散射能力，從而產(chǎn)生能夠區(qū)別各種結(jié)構(gòu)的反差，在鏡下可看到生物樣品的超微結(jié)構(gòu)；RER,G-6-PasePlasmalemma,AlPMito.,SDH巨噬細胞吞噬病毒的過程掃描電子顯微鏡(SEM)掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope,

SEM）是將電子槍所發(fā)射出來的很細的電子束照射在樣品上，并在樣品表面作光柵掃描。樣品受電子束轟擊而被激發(fā)出二次電子等信息，再經(jīng)二次電子檢測器收集，視頻放大器放大，最后在顯像管的熒光屏上顯示出反映樣品表面形貌的掃描圖象。因此，SEM圖象與樣品表面被激發(fā)的二次電子數(shù)量密切相關(guān)，并依靠二次電子的多少形成圖像的反差，而二次電子的數(shù)量又隨著樣品表面的形貌和組成樣品的元素成份不同而變化。這樣就使SEM成為最適于觀察、分析各種物體表面細微結(jié)構(gòu)的一種理想儀器，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、生物學及其他科學和生產(chǎn)領(lǐng)域。SEM的特點⑴觀察表面形貌，富于立體感；⑵景深長，立體感強；⑶放大范圍廣，分辨率高（放大倍數(shù)可從10倍～10萬倍）；⑷可觀察塊狀標本；⑸樣品制備簡單；⑹可結(jié)合元素分析。廈門大學分析測試中心：德國里奧電鏡有限公司LEO-1530掃描電子顯微鏡系統(tǒng)

掃描電子顯微鏡在生物醫(yī)學領(lǐng)域中應(yīng)用常規(guī)技術(shù)用于觀察一般生物個體表面形態(tài)、以及其表面有無異物存在和形變發(fā)生；胎兒舌乳頭上的絲狀乳頭（A）和菌狀乳頭（B）BBAAABB蒼蠅的復眼掃描電鏡和透射電鏡比較項目掃描電鏡透射電鏡分辨本領(lǐng)70～100?2?放大倍數(shù)20～40萬倍100萬倍加速電壓1～50KV幾十千伏～幾百千伏圖像特點景深較大、三維立體結(jié)構(gòu)景深小、兩維平面結(jié)構(gòu)樣品制備固定-脫水-臨界點干燥-噴涂金屬固定-脫水-包埋-超薄切片-重金屬染色樣品尺寸1cm350～100nm切片樣品損傷光斑直徑只有幾十埃的電子束在樣品上掃描，對樣品損傷極小大約1μm直徑電子束打到樣品上，造成一定程度損傷樣品成像信號二次電子、背散射電子透射電子放大倍數(shù)調(diào)節(jié)用衰減器改變掃描線圈電流，進行放大率調(diào)節(jié)調(diào)整中間鏡電流改變放大率決定分辨率因素入射電子束直徑?jīng)Q定圖像分辨率。加速電壓、透鏡縮小率、電源穩(wěn)定度及像差決定電子束斑直徑加速電壓、電源穩(wěn)定度、像差、樣品厚度等影響分辨率電