醋酸纖維薄膜電泳原理步驟詳細(xì)

講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4第2頁,共33頁，2024年2月25日，星期天一、醋酸纖維素（Celluloseacetate）

是纖維素醋酸酯(acetateesterofcellulose)，由纖維素的羥基進(jìn)行乙?；笾频?，將它溶于有機(jī)溶劑涂抹成均勻的薄膜，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，即為白色不透明的醋酸纖維薄膜厚度：0.15mm第3頁,共33頁，2024年2月25日，星期天MagnificationofCelluloseAcetatefilter

第4頁,共33頁，2024年2月25日，星期天講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4第5頁,共33頁，2024年2月25日，星期天二、醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

CharacteristicsofCelluloseAcetateMembrane

1.吸附作用小2.電滲(electroosmosis)作用小3.需加樣量少4.親水性較小

第6頁,共33頁，2024年2月25日，星期天血清蛋白質(zhì)各組分的相對分子重量及等電點(diǎn)

MolecularweightandisoelectricpointofserumproteinsserumproteinMW

pIAlb

1

2

6624813000020000013000001500000

4.865.025.025.126.8～7.3

第7頁,共33頁，2024年2月25日，星期天Amidoblack10B第8頁,共33頁，2024年2月25日，星期天氨基黑10B染色洗脫法結(jié)果蛋白組分

平均值（%）

參考范圍

（%）Alb

1

2

65.593.126.169.0917.4057.45～71.731.76～4.484.04～8.286.79～11.3911.85～22.97第9頁,共33頁，2024年2月25日，星期天PonceauS第10頁,共33頁，2024年2月25日，星期天麗春紅S染色掃描法結(jié)果

蛋白組分

g/L

占蛋白百分?jǐn)?shù)（%）

Alb

35～5257～68

1

1.0～4.01.0～5.7

2

4.0～8.04.9～11.2

5.0～10.07.0～13

6.0～13.09.8～18.2第11頁,共33頁，2024年2月25日，星期天Schematicrepresentationofaproteinelectrophoresis

第12頁,共33頁，2024年2月25日，星期天幾種疾病的蛋白電泳變化

Abnormalserumproteinelectrophoresis病名

Alb

1

2

腎病肝硬化原發(fā)性肝癌多發(fā)性骨髓瘤慢性炎癥無丙種球蛋白癥雙白蛋白血癥↓↓↓↓↓↓↓

↑↓AFP

↑↑↑↓

↑

↑

-

橋

↑

↓↑↑↑↑↑↑↓↓

第13頁,共33頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

-

橋第15頁,共33頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共33頁，2024年2月25日，星期天雙白蛋白血癥第17頁,共33頁，2024年2月25日，星期天講課內(nèi)容

醋酸纖維素

1

醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

2

影響電泳結(jié)果的因素

3

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4第18頁,共33頁，2024年2月25日，星期天三、影響電泳結(jié)果的因素

Factorsaffectingresults1.

電泳圖譜不齊①點(diǎn)樣時(shí)血清點(diǎn)加不均勻②薄膜局部干燥③電泳時(shí)供給薄膜的液量不均勻或過少④緩沖液變質(zhì)⑤電泳時(shí)薄膜位置不正,與電流方向不平行

第19頁,共33頁，2024年2月25日，星期天2.電泳圖譜分離不清①標(biāo)本加量過多②電流過低③薄膜結(jié)構(gòu)過分致密，透水性差④薄膜表面干燥第20頁,共33頁，2024年2月25日，星期天3.

電泳速度慢①電流過低②供給薄膜的液量不足③電泳時(shí)溫度過低④緩沖液離子強(qiáng)度過高⑤薄膜中雜質(zhì)多第21頁,共33頁，2024年2月25日，星期天4.

白蛋白（Albumin)區(qū)帶中間部分不著色，染色不足可能為染料使用過久或加血清(Serum)過多5.γ球蛋白(γ-globin)向反方向移動(dòng)主要因?yàn)殡姖B（electro-osmosis）現(xiàn)象可升高緩沖液液面或加大電流量加以改進(jìn)，并注意兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液液面是否在同一水平。第22頁,共33頁，2024年2月25日，星期天講課內(nèi)容

醋酸纖維素

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醋酸纖維薄膜的特點(diǎn)

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影響電泳結(jié)果的因素

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血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

4第23頁,共33頁，2024年2月25日，星期天血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳

Separateserumproteinincelluloseacetatemembraneelectrophoresis

第24頁,共33頁，2024年2月25日，星期天[原理]CAME是以醋纖膜（CAM）作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。將血清樣品點(diǎn)樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳時(shí)，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點(diǎn)不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。Ionshavedifferentmigrationratesdependingontheirtotalcharge,size,andshape,andcanthereforebeseparated.

第25頁,共33頁，2024年2月25日，星期天EQV=————6

r

第26頁,共33頁，2024年2月25日，星期天[器材和試劑]1.器材（1）醋酸纖維薄膜（8×2mm）（2）點(diǎn)樣器（3）染色皿，漂洗器，鑷子（4）722型分光光度計(jì)（5）電泳儀：直流電源整流器，水平電泳槽2.試劑（1）巴比妥緩沖液（pH8.6I=0.06）（2）氨基黑10B染色液（3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O（4）洗脫液：0.4mol/LNaOH第27頁,共33頁，2024年2月25日，星期天[操作]1.將電泳槽置于水平平臺上。將緩沖液注入電泳槽中兩邊的電極槽緩沖液的高度要在同一點(diǎn)平面上2.在醋纖膜一端欲點(diǎn)樣處作好標(biāo)記，然后將薄膜放進(jìn)緩沖液中，濕潤速度按膜吸收緩沖液的快慢而定，應(yīng)讓其自然浸潤3.將充分浸透（指膜上沒有白色斑痕）的薄膜取出，用濾紙吸去膜上過多的緩沖液4.用加樣器蘸取血清（約5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待樣品全部滲入薄膜內(nèi)后，移開點(diǎn)樣器第28頁,共33頁，2024年2月25日，星期天醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖第29頁,共33頁，2024年2月25日，星期天5．電泳(Electrophoresis)（1）加樣后，將薄膜條架于支架兩端，無光澤面朝下（點(diǎn)樣面），點(diǎn)樣側(cè)置于陰極端，膜兩側(cè)分別塔上紗布，紗布一端垂入緩沖液中。薄膜應(yīng)位正，平直無彎曲，加上槽蓋平衡5分鐘后通電電泳（2）正確連接電泳槽與整流器對應(yīng)的正負(fù)極。開啟電源通電。電壓10~15V/cm膜總寬。電泳40~60分鐘，泳動(dòng)距離約達(dá)3.5~4cm時(shí)即可斷電第30頁,共33頁，2024年2月25日，星期天醋酸纖維素薄膜電泳裝置示意圖第31頁,共33頁，2024年2月25日，星期天6.染色(Sta