DB32T3762.16-2021新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范 第16部分：核酸數(shù)字PCR法

ICS13.100

C50

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T3762.16—2021

新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范

第16部分：核酸數(shù)字PCR法

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part16:NovelcoronavirusnucleicaciddigitalPCRtestprocedure

2021-12-09發(fā)布2022-01-09實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3762.16—2021

前??言

DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范》目前分為以下部分：

——第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；

——第2部分：病毒分離與鑒定；

——第3部分：核酸熒光PCR檢測程序；

——第4部分：重組酶介導等溫擴增程序；

——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測程序；

——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；

——第7部分：空氣樣本檢測與評估；

——第8部分：物體表面檢測與評估；

——第9部分：醫(yī)務人員職業(yè)暴露檢測與評估；

——第10部分：微量血清中和試驗；

——第11部分：全基因組高通量測序；

——第12部分：藥物體外抗病毒效果測定；

——第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序；

——第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序；

——第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微粒化學發(fā)光法檢測程序；

——第16部分：核酸數(shù)字PCR法；

——第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質(zhì)控品；

——第18部分：規(guī)模化核酸檢測程序。

本文件為DB32/T3762的第16部分。

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出。

本文件由江蘇省衛(wèi)生標準化技術委員會歸口。

本文件主要起草單位：江蘇省疾病預防控制中心、南京市計量監(jiān)督檢測院、蘇州市疾病預防控制中

心、泰州市疾病預防控制中心、蘇州銳訊生物科技有限公司、北京新羿生物科技有限公司。

本文件主要起草人：洪捷、林婧、蔣云宇、周愷、周連、王慎驕、朱立國、王尚君、范宇宸、朱寶

立、王雅琦、李家琛、董嘉、祝令香、王楠。

II

DB32/T3762.16—2021

新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第16部分：核酸數(shù)字PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR檢測方法。

本文件適用于新冠病例、一般人群和重點人群的生物樣本，包括口咽拭子、鼻咽拭子、血標本、肛

拭子等，以及其他需要檢測的樣本的核算數(shù)字PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序

3術語和定義

本文件沒有界定的術語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

數(shù)字PCR：數(shù)字聚合酶鏈式反應（digitalpolymerasechainreaction）

ORF1a/b：開放閱讀框1a/b（openreadingframe）

dNTPs：脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

人RNaseP基因：人核糖體核酸酶基因（RibonucleaseP）

5原理

一種對核酸分子進行絕對定量的實驗技術，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應

單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標分子。在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴

增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，進而計算出原始樣本中目標分子濃度。

目前數(shù)字PCR技術包括芯片式和微滴式兩種，芯片式通過微流控芯片實現(xiàn)對原始反應體系的分

割，該方法具有穩(wěn)定性好，均一性好的優(yōu)點，但檢測成本相對較高。微滴式通過產(chǎn)生微小油包水體系實

現(xiàn)體系的分割，該方法有反應速度快，檢測成本低的優(yōu)點。為了實現(xiàn)對新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR的定

量檢測，本標準通過數(shù)字PCR的擴增反應直接得出新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的拷貝數(shù)。

6基本要求

6.1實驗室資質(zhì)及級別

1

DB32/T3762.16—2021

檢測工作應在BSL-2級實驗室進行。生物安全要求遵照GB19489和DB32/T3762.3規(guī)定執(zhí)行。

6.2操作人員資質(zhì)及防護

實驗過程中的個人防護遵照GB19489第8條和DB32/T3762.3規(guī)定執(zhí)行。

7試劑與材料

7.1新冠病毒核酸提取試劑盒：應當選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準的試劑，建議選擇磁珠法、膜吸

附法等進行核酸提取。

7.2新冠病毒數(shù)字PCR預混液：含有鎂離子，dNTPs、RNA酶抑制劑、逆轉錄酶和DNA聚合酶等組

分的數(shù)字PCR預混液，推薦根據(jù)不同的數(shù)字PCR方法和儀器選擇不同的試劑。

7.3引物序列和探針：檢測新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探針序列見表1。

表1新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探針序列

標靶名稱序列

新型冠狀病毒上游引物CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1ab基因下游引物ACGATTGTGCATCAGCTGA

探針5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

新型冠狀病毒N基上游引物GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

因下游引物CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

探針5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

8儀器與設備

8.1生物安全柜。

8.2生物安全型離心機。

8.3渦旋振蕩器。

8.4恒溫金屬浴。

8.5核酸提取儀。

8.6數(shù)字PCR儀。

9操作步驟

9.1樣本前處理

2

DB32/T3762.16—2021

按照DB32/T3762.3中的7.1規(guī)定執(zhí)行。

9.2核酸提取

按照DB32/T3762.3中的7.2規(guī)定執(zhí)行。

9.3數(shù)字PCR擴增方法

9.3.1數(shù)字PCR反應體系

數(shù)字PCR儀反應體系的總體積根據(jù)不同廠家、不同型號的儀器設備需進行相應的調(diào)整，并保持各引

物探針組分終濃度不變。

9.3.2數(shù)字PCR反應程序

數(shù)字PCR反應程序如表2，不同方法和不同儀器設備及試劑反應程序可能存在差異，需進行調(diào)整。

表2數(shù)字PCR反應程序

步驟溫度時間循環(huán)數(shù)

150℃60min1cycle

295℃10min1cycle

95℃30s

340cycles

55℃1min

498℃10min1cycle

54℃5min1cycle

9.3.3對照數(shù)字PCR反應的設定

試驗中應設置陽性對照和陰性對照。用含2019-nCoVORF1ab基因特異片段的病毒樣顆粒、含

2019-nCoVN基因特異片段的病毒樣顆粒和含人RNaseP基因特異片段的質(zhì)粒作為陽性對照。用無核

酶水作為陰性對照。

9.4質(zhì)量控制與結果分析

9.4.1質(zhì)量控制

以下要求其中一條不符合，應重新進行試驗，重新進行試驗應從核酸提取開始：

a)樣本人RNaseP基因有熒光信號檢出；

b)陰性對照無熒光信號；

c)陽性對照兩個靶標（ORF1ab、N）熒光信號均超過設定閾值。

9.4.2陽性判定

實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個：

3

DB32/T3762.16—2021

a)同一份樣本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）數(shù)字PCR檢測結果均＞100copies/mL。

如果出現(xiàn)單個靶標＞100copies/mL的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。如果單靶標仍

＞100copies/mL，判定為陽性；

b)同一病例的兩種不同類型樣本數(shù)字PCR同時出現(xiàn)單靶標＞100copies/mL，或同種類型樣本兩

次采樣檢測中均出現(xiàn)單個靶標＞100copies/mL的檢測結果，可判定為陽性。

9.4.3陰性判定

在質(zhì)量控制符合要求的情況下，如果樣本兩個靶標（ORF1ab、N）沒有檢測出熒光信號，則判定

為陰性。

4

DB32/T3762.16—2021

目??次

前??言.................................................................................................................................................II

1范圍.....................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.................................................................................................................................1

3術語和定義.........................................................................................................................................1

4縮略語.................................................................................................................................................1

5原理.....................................................................................................................................................1

6基本要求.............................................................................................................................................2

7試劑與材料.........................................................................................................................................2

8儀器與設備.........................................................................................................................................2

9操作步驟.............................................................................................................................................2

I

DB32/T3762.16—2021

新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第16部分：核酸數(shù)字PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR檢測方法。

本文件適用于新冠病例、一般人群和重點人群的生物樣本，包括口咽拭子、鼻咽拭子、血標本、肛

拭子等，以及其他需要檢測的樣本的核算數(shù)字PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

DB32/T3762.3新型冠狀病毒檢測技術規(guī)范第3部分：核酸熒光PCR檢測程序

3術語和定義

本文件沒有界定的術語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

數(shù)字PCR：數(shù)字聚合酶鏈式反應（digitalpolymerasechainreaction）

ORF1a/b：開放閱讀框1a/b（openreadingframe）

dNTPs：脫氧核糖核酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

人RNaseP基因：人核糖體核酸酶基因（RibonucleaseP）

5原理

一種對核酸分子進行絕對定量的實驗技術，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應

單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標分子。在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴

增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，進而計算出原始樣本中目標分子濃度。

目前數(shù)字PCR技術包括芯片式和微滴式兩種，芯片式通過微流控芯片實現(xiàn)對原始反應體系的分

割，該方法具有穩(wěn)定性好，均一性好的優(yōu)點，但檢測成本相對較高。微滴式通過產(chǎn)生微小油包水體系實

現(xiàn)體系的分割，該方法有反應速度快，檢測成本低的優(yōu)點。為了實現(xiàn)對新型冠狀病毒核酸數(shù)字PCR的定

量檢測，本標準通過數(shù)字PCR的擴增反應直接得出新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的拷貝數(shù)。

6基本要求

6.1實驗室資質(zhì)及級別

1

DB32/T3762.16—2021

檢測工作應在BSL-2級實驗室進行。生物安全要求遵照GB19489和DB32/T3762.3規(guī)定執(zhí)行。

6.2操作人員資質(zhì)及防護

實驗過程中的個人防護遵照GB19489第8條和DB32/T3762.3規(guī)定執(zhí)行。

7試劑與材料

7.1新冠病毒核酸提取試劑盒：應當選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準的試劑，建議選擇磁珠法、膜吸

附法等進行核酸提取。

7.2新冠病毒數(shù)字PCR預混液：含有鎂離子，dNTPs、RNA酶抑制劑、逆轉錄酶和DNA聚合酶等組

分的數(shù)字PCR預混液，推薦根據(jù)不同的數(shù)字PCR方法和儀器選擇不同的試劑。

7.3引物序列和探針：檢測新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探針序列見表1。

表1新冠病毒ORF1a/b基因和N基因的引物和探針序列

標靶名稱序列

新型冠狀病毒上游引物CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1ab基因下游引物ACGATTGTGCATCAGCTGA

探針5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

新型冠狀病毒N基上游引物GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

因下游引物CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

探針5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

8儀器與設備

8.1生物安全柜。

8.2生物安全型離心機。

8.3渦旋振蕩器。

8.4恒溫金屬浴。

8.5核酸提取儀。

8.6數(shù)字PCR儀。

9操作步驟

9.1樣本前處理

2

DB32/T3762.16—2021

按照DB32/T3762.3中的7.1規(guī)定執(zhí)行。

9.2核酸提取

按照DB32/T3762.3中的7.2規(guī)定執(zhí)行。

9.3數(shù)字PCR擴增方法

9.3.1數(shù)字PCR反應體系

數(shù)字PCR儀反應體系的總體積根據(jù)不同廠家、不同型號的儀器設備需進行相應的調(diào)整，并保持各引

物探針組分終濃度不變。

9.3.2數(shù)字PCR反應程序

數(shù)字PCR反應程序如表2，不同方法和不同儀器設備及試劑反應程序可能存在差異，需進行調(diào)整。

表2數(shù)字PCR反應程序

步驟溫度時間循環(huán)數(shù)

150℃60min1cycle

295℃10min1cycle

95℃30s

340cycles

55