酶的化學(xué)修飾

酶的化學(xué)修飾第五章

酶的化學(xué)修飾第一節(jié)

概述

第二節(jié)

酶分子化學(xué)修飾的方法學(xué)

第三節(jié)

酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾

第四節(jié)

有機(jī)大分子對(duì)酶的修飾

第五節(jié)金屬離子置換修飾及物理修飾第六節(jié)

酶化學(xué)修飾的應(yīng)用

第2頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

概述

一、概念二、進(jìn)行化學(xué)修飾的原因三、化學(xué)修飾的基本原理四、修飾酶的特點(diǎn)第3頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、概念酶的化學(xué)修飾利用各種修飾劑具有的化學(xué)基團(tuán)，與酶分子上某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)修飾酶在體外用一定的化學(xué)方法將酶和一些試劑進(jìn)行共價(jià)連接后而形成的酶體外改造第4頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、進(jìn)行化學(xué)修飾的原因穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要作用的最適條件不符，活性不高臨床應(yīng)用的特殊要求：可能具有抗原性第5頁,共72頁，2024年2月25日，星期天三、化學(xué)修飾的基本原理1、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑3、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境第6頁,共72頁，2024年2月25日，星期天四、修飾酶的特點(diǎn)1、熱穩(wěn)定性增加2、增加抗抑制劑、抗蛋白水解酶能力，體內(nèi)半衰期延長3、消除了酶的抗原性4、微環(huán)境穩(wěn)定性增強(qiáng)，最適pH改變5、酶學(xué)性質(zhì)改變第7頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)結(jié)束概念進(jìn)行化學(xué)修飾的原因

化學(xué)修飾的基本原理修飾酶的特點(diǎn)第8頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回

第9頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

酶分子化學(xué)修飾的方法學(xué)

一、修飾需考慮的問題二、選擇酶分子修飾劑三、修飾反應(yīng)的一般程序四、測(cè)定修飾程度和修飾部位五、酶的修飾方法第10頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、修飾需考慮的問題1、

酶性質(zhì)的了解(1)酶活性部位情況(2)酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件(3)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等第11頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、修飾需考慮的問題2、選擇反應(yīng)條件(1)

反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例(2)

反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)，pH條件和離子強(qiáng)度(3)

反應(yīng)溫度及時(shí)間(4)其它第12頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、選擇酶分子修飾劑

修飾劑須具備的特性1、能選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)2、

反應(yīng)在保證酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行3、

被標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定，容易通過降解分離出來并鑒定4、反應(yīng)程度能用簡單的技術(shù)測(cè)定第13頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、選擇酶分子修飾劑

修飾劑的選擇1、修飾劑的相對(duì)分子質(zhì)量、修飾劑鏈的長度對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性2、

修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置3、

修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件第14頁,共72頁，2024年2月25日，星期天三、修飾反應(yīng)的一般程序修飾反應(yīng)終止稀釋陽離子交換洗滌過濾干燥第15頁,共72頁，2024年2月25日，星期天三、修飾反應(yīng)的一般程序注意事項(xiàng)修飾后需進(jìn)行總的氨基酸分析各種酶分子，修飾后均需對(duì)每個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行確定注意緩沖液成分或修飾副產(chǎn)物對(duì)修飾部位和修飾程度及對(duì)酶活性的影響修飾后酶性質(zhì)的改變第16頁,共72頁，2024年2月25日，星期天四、測(cè)定修飾程度和修飾部位修飾反應(yīng)的評(píng)價(jià)因素1、

有多少修飾劑已結(jié)合到酶分子上2、

哪些氨基酸被修飾，修飾度是多少3、

有多少種不同形式的修飾劑－酶分子耦合物，每種各有多少4、表面修飾、內(nèi)部修飾

測(cè)定方法第17頁,共72頁，2024年2月25日，星期天五、

酶的修飾方法側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾大分子結(jié)合修飾其他(金屬離子置換修飾、物理修飾)第18頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)結(jié)束酶分子性質(zhì)的了解

選擇酶分子修飾劑

選擇反應(yīng)條件修飾反應(yīng)要注意的其它問題修飾反應(yīng)的一般程序測(cè)定修飾程度和修飾部位酶的修飾方法第19頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回

第20頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾

一、概述二、幾種重要的修飾反應(yīng)三、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第21頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、概述側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法(一般為化學(xué)法)使酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法酶側(cè)鏈基團(tuán)組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。有氨基、羧基、巰基、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等第22頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、概述作用研究各基團(tuán)的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響(研究酶活性中心的必需基團(tuán))改變酶分子性質(zhì)，提高實(shí)用價(jià)值測(cè)定某一基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量獲得新酶種第23頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、概述類別蛋白類酶核酸類酶

側(cè)鏈基團(tuán)：磷酸基，核糖上的羥基，嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基(酮基)等第24頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、幾種重要的修飾反應(yīng)?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)烷基化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)第25頁,共72頁，2024年2月25日，星期天?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)第26頁,共72頁，2024年2月25日，星期天烷基化反應(yīng)

第27頁,共72頁，2024年2月25日，星期天氧化和還原反應(yīng)

第28頁,共72頁，2024年2月25日，星期天芳香環(huán)取代反應(yīng)

定量測(cè)定第29頁,共72頁，2024年2月25日，星期天三、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾巰基氨基羧基咪唑基胍基二硫鍵第30頁,共72頁，2024年2月25日，星期天1、巰基的化學(xué)修飾

巰基：許多酶活性中心的催化基團(tuán)；形成二硫鍵，穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)巰基具有很強(qiáng)的親核性，采用巰基修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。提高酶的穩(wěn)定性常用：?；?、烷基化劑、馬來酰亞胺、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉第31頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共72頁，2024年2月25日，星期天2、氨基的化學(xué)修飾

氨基的甲基化與乙?；嚢彼?、精氨酸、組氨酸、谷氨酰胺的側(cè)鏈氨基；谷氨酰胺和天冬氨酸羧基的-OH上甲基轉(zhuǎn)移酶氨基的烷基化脫氨基作用或與氨基共價(jià)結(jié)合，屏蔽酶分子側(cè)鏈上的氨基修飾劑：亞硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯第33頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共72頁，2024年2月25日，星期天3、羧基的化學(xué)修飾

修飾劑與酶分子側(cè)鏈的羧基進(jìn)行酯化、?；确磻?yīng)修飾劑：碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇-鹽酸試劑、異噁唑鹽等第35頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共72頁，2024年2月25日，星期天4、咪唑基的化學(xué)修飾

組氨酸。許多酶活性中心的必需基團(tuán)修飾劑通過咪唑基氮原子的烷基化或碳原子的親核取代進(jìn)行修飾修飾劑：碘乙酸、焦碳酸二乙酯第37頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共72頁，2024年2月25日，星期天5、胍基的化學(xué)修飾

精氨酸。在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起重要作用一些二羰基化合物在中性或弱堿性條件下與精氨酸胍基生成穩(wěn)定的雜環(huán)修飾劑：丁二酮、1,2-環(huán)己二酮、丙二醛、苯乙二醛等第39頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共72頁，2024年2月25日，星期天6、二硫鍵的化學(xué)修飾

同巰基基團(tuán)類似還原方法與巰基修飾方法結(jié)合，阻止再氧化成二硫鍵?？捎糜谟?jì)算斷裂的二硫鍵數(shù)目修飾劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、過甲酸等第41頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)結(jié)束酰化及其相關(guān)反應(yīng)烷基化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)巰基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾概述

幾種重要的修飾反應(yīng)

特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第43頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回

第44頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)

大分子結(jié)合修飾一、概念二、大分子結(jié)合修飾的方法三、大分子結(jié)合修飾的作用第45頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、概念利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡稱為大分子結(jié)合法第46頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、大分子結(jié)合修飾的方法修飾劑的選擇修飾劑的活化修飾分離第47頁,共72頁，2024年2月25日，星期天1、修飾劑的選擇水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等PEG:1－10KD。溶解度高，無抗原性，無毒性，生物相容性好第48頁,共72頁，2024年2月25日，星期天2、修飾劑的活化需活化才能與酶分子側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)eg.單甲氧基聚乙二醇(MPEG)(1)聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1,MPEG2。對(duì)天冬酰胺酶等的氨基進(jìn)行修飾(2)聚乙二醇琥珀酰亞胺衍生物SS-MPEG,SSA-MPEG,SC-MPEG。pH7-10條件下對(duì)酶分子氨基進(jìn)行修飾(3)聚乙二醇馬來酸酐衍生物PM。其中的馬來酸酐通過酰胺鍵對(duì)酶分子上氨基進(jìn)行修飾(4)聚乙二醇胺類衍生物對(duì)酶分子上的羰基進(jìn)行修飾第49頁,共72頁，2024年2月25日，星期天3、修飾將活化大分子修飾劑與經(jīng)分離純化的酶液以一定比例混合，在一定溫度、pH等條件下反應(yīng)。使修飾劑活化基團(tuán)與酶分子側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，進(jìn)行修飾第50頁,共72頁，2024年2月25日，星期天4、分離通過凝膠層析等方法，將具有不同修飾程度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶第51頁,共72頁，2024年2月25日，星期天三、大分子結(jié)合修飾的作用提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性降低或消除抗原性酶半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70ficoll(低分子量)-SOD14h140ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350天然SOD與修飾后SOD在人體血漿中的半衰期第52頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)結(jié)束概念

大分子結(jié)合修飾的方法

大分子結(jié)合修飾的作用修飾劑的選擇修飾劑的活化修飾分離提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性降低或消除抗原性第53頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回

第54頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)金屬離子置換修飾及物理修飾一、金屬離子置換修飾二、物理修飾第55頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、金屬離子置換修飾1、

概念

把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法，稱為金屬離子置換修飾第56頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、金屬離子置換修飾2、

方法

酶分離純化除去原有金屬離子加入置換離子加入金屬螯合劑(EDTA)，形成螯合物，透析、超濾、分子篩層析等除去一般都是二價(jià)金屬離子。例如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等只適用于哪些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶第57頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、金屬離子置換修飾3、

作用

闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性改變酶的動(dòng)力學(xué)特性第58頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、物理修飾1、

概念

通過各種物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法，稱為酶分子的物理修飾第59頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、物理修飾2、

作用

了解在不同物理?xiàng)l件下，由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況探索極端環(huán)境中生物的生存可能性及其潛力提高酶的催化活性，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，改變酶的催化動(dòng)力學(xué)特性第60頁,共72頁，2024年2月25日，星期天二、物理修飾3、

特點(diǎn)

不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變。只是副鍵發(fā)生某些變化和重排可在某些變性劑作用下，首先破壞酶分子原有的空間構(gòu)象，然后在不同物理?xiàng)l件下，使酶分子重新構(gòu)建新的空間構(gòu)象第61頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)結(jié)束金屬離子置換修飾

物理修飾概念方法作用概念作用特點(diǎn)第62頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)結(jié)束點(diǎn)擊返回

第63頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)

酶化學(xué)修飾的應(yīng)用

一、在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用三、在工業(yè)方面的應(yīng)用四、在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用化學(xué)修飾方法的局限性第64頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用酶的活性中心研究酶的空間結(jié)構(gòu)研究

采用具有熒光特性的修飾劑，可借助熒光光譜研究，分析各基團(tuán)在酶分子中的空間分布情況采用巰基修飾劑，可了解酶分子中半胱氨酸的數(shù)目及分布情況，確定肽鏈的數(shù)目和二硫鍵的數(shù)目酶的作用機(jī)制研究了解各種殘基及側(cè)鏈基團(tuán)在