醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)并定量

實(shí)驗(yàn)五

醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)并定量1精品醫(yī)學(xué)ppt目的

學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理和方法學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)染色的方法了解電泳法分離血清蛋白質(zhì)的臨床意義

2精品醫(yī)學(xué)ppt原理

1、電泳（electrophoresis）法在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場(chǎng)中將向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動(dòng)這種現(xiàn)象稱為電泳。3精品醫(yī)學(xué)ppt電泳影響因素蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度取決于蛋白質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)、數(shù)量及質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀；此外還受外界因素的影響如，電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的PH、離子強(qiáng)度及電滲等。常見的有：醋酸纖維膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳4精品醫(yī)學(xué)ppt醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜作為支持介質(zhì)醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙酰化為醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一細(xì)密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

5精品醫(yī)學(xué)ppt血漿蛋白：(1)清蛋白（Alb）、α1、α2、β、纖維蛋白原和γ-球蛋白;(2)血漿中蛋白質(zhì)的PI小于7.0，在PH8.6Buffer中解離成負(fù)離子，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。(3)在同一pH下所帶電荷量多少有差異，各蛋白質(zhì)的分子大小與分子形狀也不相同，因而在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同。6精品醫(yī)學(xué)ppt染色劑

一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色

7精品醫(yī)學(xué)ppt白蛋白a1-球蛋白a2-球蛋白β-球蛋白γ－球蛋白醋酸纖維薄膜法顯示血清蛋白質(zhì)從陽極端起依次為白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、β-球蛋白和γ－球蛋白五條區(qū)帶。8精品醫(yī)學(xué)ppt定量

與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料可溶解于堿液，溶液顏色深淺與蛋白質(zhì)量呈正比比色法比較各蛋白質(zhì)條帶溶于堿后的溶液顏色，可計(jì)算出各種蛋白質(zhì)所占的百分比9精品醫(yī)學(xué)ppt計(jì)算

OD總和T＝A+α1+α2+β+γ白蛋白％＝A/T×100％α1球蛋白％＝α1/T×100％α2球蛋白％＝α2/T×100％β球蛋白％＝β/T×100％γ球蛋白％＝γ/T×100％10精品醫(yī)學(xué)ppt操作1、準(zhǔn)備（1）電泳儀的準(zhǔn)備（2）薄膜的準(zhǔn)備：在薄膜無光澤面標(biāo)記點(diǎn)樣位置將薄膜置于巴比妥緩沖液中浸泡11精品醫(yī)學(xué)ppt2、點(diǎn)樣（1）無光澤面朝上，吸去多余Buffer,（2）用蓋玻片蘸取少量血漿，垂直印在劃線處。注意：不能超出邊緣；不能重復(fù)點(diǎn)樣；必須與邊緣平行要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。12精品醫(yī)學(xué)ppt3、平衡：無光澤面朝下，點(diǎn)樣側(cè)位于陰極（5min)4、電泳：打開電源，U＝160V或I＝1.6mAt=45－50min；冬季1小時(shí)5、染色：氨基黑10B染色充分，5－10min6、漂洗：3－4個(gè)漂洗皿，洗去染料至背景無色。13精品醫(yī)學(xué)ppt臨床意義血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為60～80g/L，絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值： 白蛋白57％—72％α1球蛋白2％—5％α2球蛋白4％—9％β球蛋白6.5％—12％γ球蛋白12％—20％

14精品醫(yī)學(xué)ppt血漿蛋白的主要功能

維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用

15精品醫(yī)學(xué)ppt肝炎：白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、β-球蛋白下降，γ－球蛋白升高肝