醫(yī)學生物實驗技術(shù)指南

《細胞生物技術(shù)試驗指南》

刁勇徐瑞安主編

第一章細胞與生物技術(shù)基礎

第一節(jié)細胞生物學

1.生物細胞學研究，應采取分析與綜合相結(jié)合的方法，從細胞整體、亞顯微結(jié)

構(gòu)以及分子三個不同層次將細胞的結(jié)構(gòu)和功能有機結(jié)合并進行討論。

2.細胞生物學研究的重點內(nèi)容：

⑴生物膜結(jié)構(gòu)與功能研究：一系列生命活動。

⑵細胞骨架體系研究

細胞骨架是真核細胞細胞器，包括微絲、微管和中間纖維。在真核細胞

的核內(nèi)，除染色體、核仁、核膜外，還有一個以蛋白質(zhì)為主的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)

體系，稱為核骨架。核骨架主要包括核基質(zhì)、核纖層和核孔復合體，其

在染色體的構(gòu)建及基因表達中具有重要作用。

(3)真核細胞的細胞核、染色體和基因表達的研究

細胞核與染色體的研究素為經(jīng)典細胞學重點,現(xiàn)代細胞生物學核心課題之

一就是研究染色體結(jié)構(gòu)動態(tài)變化與基因表達及其調(diào)控的關系。

(4)細胞增值與調(diào)控

?切動植物的生長與發(fā)育都是通過細胞增殖和分化來實現(xiàn)的。研究細胞

的增殖的基本規(guī)律及其調(diào)控機制不僅是控制生物生長與發(fā)育的基礎，而

且是研究癌變的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)的重要途徑。

⑸細胞的分化及調(diào)控

細胞分化是指在個體發(fā)育中，由一種相同的細胞類型經(jīng)細胞分裂后逐漸

暫形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面形成穩(wěn)定性差異，從而產(chǎn)生不同類型的細胞類

群的過程。分化是個體產(chǎn)生穩(wěn)定性組織的過程。是細胞內(nèi)基因選擇性表

達特異功能性蛋白的過程。

(6)細胞衰老與凋亡

細胞衰老與機體的衰老是不同的概念。動物的二倍體細胞在體外分裂與

傳代的次數(shù)是有限的。細胞凋亡是…系列基因控制并受復雜信號調(diào)節(jié)的

細胞自然死亡的現(xiàn)象。

(7)細胞起源與進化：推理性為主。

(8)細胞工程

細胞工程是細胞生物學與遺傳學的交叉領域，這種改造技術(shù)是生物工程

技術(shù)的重要組成部分。動植物體細胞雜交試驗一直是細胞工程最活躍的

領域。

⑼細胞信號轉(zhuǎn)導與通訊

細胞與細胞之間相互反應與相互作用為細胞通訊。細胞將周圍環(huán)境中信

號轉(zhuǎn)化為某種功能上的變化，從而調(diào)節(jié)代謝變化。

(10)細胞結(jié)構(gòu)體系裝配

在亞細胞水平上，可將細胞結(jié)構(gòu)大致歸納為三個基本體系：蛋白質(zhì)和核

酸構(gòu)成的遺傳信息結(jié)構(gòu)體系(染色體、核糖體、核仁)，由蛋白質(zhì)與脂質(zhì)

構(gòu)成的細胞膜(細胞膜、核膜與各種細胞器膜)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)構(gòu)成的

細胞骨架結(jié)構(gòu)體系。裝配、去裝配、重裝配與重建過程。

(11)干細胞及其應用

干細胞是體內(nèi)最原始的細胞，它具有較強的再生能力，在一定的條件下

可分化擴增出格雷細胞。由于干細胞數(shù)量較少，所以分離、保存并在體

外大量培養(yǎng)使之成長為各種組織和器官便成為干細胞研究的主要課題。

目前取得較大進展的是造血干細胞、胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞。

3.細胞生物學技術(shù)

⑴細胞形態(tài)觀察技術(shù)：

1)光學顯微鏡技術(shù)：

①普通光學顯微鏡技術(shù)；

②熒光顯微鏡技術(shù)-免疫熒光技術(shù)和熒光素直接標記技術(shù)；

③激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)：在熒光顯微鏡成像技術(shù)基礎上，以

單色激光為光源，是樣品被激發(fā)出熒光，利用計算機進行圖像處理，從

而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像。

④相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)-把光程差變成振幅差，提高各種結(jié)構(gòu)

的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變的清晰可見。

⑤暗視野顯微鏡技術(shù)-原理是給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是

由樣品上反射或者折射的光進入物鏡。因此漆黑的視野中，反差增大使

樣品更清楚。

2）電子顯微鏡技術(shù)

觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電競不能直接觀察自然狀態(tài)下的生物標本，必須先通

過各種技術(shù)將生物標本制成合適的電鏡觀察樣品。

3）掃描隧道顯微鏡技術(shù)

掃描隧道顯微鏡是用來顯示晶體表面原子布陣，其可以直接觀察DNA、RNA

和蛋白質(zhì)等生物大分子及生物膜、病毒等的結(jié)構(gòu)。

⑵細胞化學技術(shù)

細胞化學技術(shù)，是保持細胞結(jié)構(gòu)條件下，通過一定的化學染色手段將細

胞內(nèi)或細胞膜上的某種化學成分顯示出來的一種技術(shù)。

1）酶細胞化學技術(shù)：酶細胞化學技術(shù)既保持細胞在結(jié)構(gòu)完整性，又將酶

在細胞上不同的結(jié)構(gòu)上進行定位，并保持活性。該技術(shù)是利用酶的

特異性細胞化學反應來顯示酶在細胞內(nèi)的分布及酶活性強弱?種技

術(shù)，使細胞結(jié)構(gòu)與功能的關系盡可能地在符合在自然狀態(tài)下得到顯示。

2）免疫細胞化學技術(shù)：又稱免疫組織化學，利用免疫學抗體與抗原特異

性結(jié)合的原理，通過組織化學技術(shù)對細胞特定的抗原或抗體進行定位

或定量的檢測，經(jīng)過組織化學呈色后，用顯微鏡、熒光顯微鏡和電子

顯微鏡觀察。

3）反射自顯影技術(shù)：放射性核素是一種不穩(wěn)定的元素，能連續(xù)不斷地進

行蛻變，在蛻變的過程中，伴隨著粒子和射線的輻射，利用放射性核

素所發(fā)射的帶電粒子，使得感光材料大聲作用，從而顯示出標本中放

射性物質(zhì)所在的位置和數(shù)量，此種方法為反射性自顯影。

（3）細胞組分分析方法

對細胞和細胞內(nèi)的組分進行深入了解，者必須對這些成分進行生物化學

的分析。

1）流式細胞技術(shù)：流式細胞技術(shù)是利用流式細胞儀分選或檢測細胞及其

組分的物理或化學特性的技術(shù)。流式細胞一可以定量測定某一細胞中

的DNA、RNA或某一特異蛋白質(zhì)的含量，以及細胞群體中上述成分及

含量成分不同的細胞的數(shù)量。

2）顯微分光光度技術(shù)：顯微分光光度技術(shù)測量是利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對

特異性光譜吸收的原理，用來測定這些物質(zhì)如核酸與蛋白質(zhì)等在每一

細胞內(nèi)的含量的一種技術(shù)。其中顯微熒光光度技術(shù)是通過測試固定組

織內(nèi)的熒光反應物來對生物標本進行定量分析。

3）生物質(zhì)譜：生物質(zhì)譜是根據(jù)生物分子治療和所載電荷數(shù)的不同，在磁

場中會產(chǎn)生不同的軌跡，從而根據(jù)質(zhì)荷比而相互分離的技術(shù)。其中有

適合蛋白質(zhì)研究的軟電離方式，ESI（電噴霧電離）和MALDL（基質(zhì)

輔助激光吸附電離）。生物質(zhì)譜的強大功能在于能夠鑒定蛋白質(zhì)復合

物的組成成分。

4）超速離心技術(shù)：根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等不同，應用強

大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮和提純的方法稱為離心。離心機的轉(zhuǎn)速

在2000r/min以上的離心機稱為超速離心機。通過不斷增加相對離心

力，使一個非均勻混合液內(nèi)的不同大小。形狀的顆粒分布沉淀，則稱

為差速離心。離心操作如果是在一種連續(xù)密度梯度介質(zhì)中進行，者稱

為密度梯度離心。

⑷細胞工程技術(shù)：細胞工程是在細胞水平上的生物工程。細胞工程所使用

的技術(shù)主要是細胞培養(yǎng)、細胞分化的定向誘導、細胞融合和顯微注射等。

細胞工程與基因工程結(jié)合，前景尤為廣闊。

⑸細胞分子生物學技術(shù)。

第二節(jié)細胞分子生物學

1.細胞分子生物技術(shù)

⑴原位雜交技術(shù)

對已知序列的DNA或RNA片段標記上可識別或可檢測的標記物，再與細

胞、組織或染色體中的核酸進行分子雜交，成為細胞、組織或染色體原

位雜交。

⑵聚合酶鏈式反應技術(shù)

聚合酶鏈式反應技術(shù)（PCR）技術(shù)又稱體外基因擴增技術(shù)。

⑶轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是根據(jù)人們的意愿對不同生物的遺傳基因進行切割、拼接或

重新結(jié)合，再應用物理、化學或生物學等技術(shù)和方法將外源基因轉(zhuǎn)移到

受體菌或細胞內(nèi)，并使之在細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴增或表達。

（4）基因敲除和敲入

應用基因的同源重組（基因打靶），即用無功能的外源基因轉(zhuǎn)入細胞與基

因組中的同源序列進行重組，把具有同源序列的有功能的基因置換出來,

造成功能基因的缺失或失活的技術(shù)成為基因敲除。相反，將外源有功能

的基因（基因組中原先不存在或已失活的基因）轉(zhuǎn)入細胞中，與基因組

中的同源序列進行重組，并且在細胞內(nèi)獲得表達的技術(shù)稱基因敲入。

⑸反義技術(shù)

能與有功能的RNA（主要是mRNA）互補結(jié)合，并干擾其功能的RNA或

DNA,稱反義核酸。利用反義核酸影響相對應的mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯，

從而改變細胞生物學功能的技術(shù)稱為反義技術(shù)。反義核酸有反義RNA和

反義DNAo

第三節(jié)細胞工程

1.基本概念

⑴根據(jù)研究對象可以將細胞工程分為微生物細胞工程、植物細胞工程、動

物細胞工程。

⑵根據(jù)研究技術(shù)而言，主要包括細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細胞融合、細胞拆

合、染色體操作、胚胎移植、細胞核移植等。

2.細胞工程技術(shù)

⑴植物細胞工程技術(shù)

植物細胞工程是在植物組織培養(yǎng)的基礎上發(fā)展起來的。它主要由兩部分

組成，其一是上游工程，包含細胞培養(yǎng)、細胞遺傳操作和細胞保藏三個

步驟。另一個則是下游工程，是將已轉(zhuǎn)化的細胞應用到實踐中去，以生

產(chǎn)生物產(chǎn)品的過程。

⑵動物細胞工程技術(shù)

動物細胞工程，主要從細胞生物學和分子生物學的層次，根據(jù)人類的需

要，一方面深入探索和改造生物的遺傳種性，另一方面是應用工程技術(shù)

的手段，大量培養(yǎng)細胞和動物本身，以期收獲細胞或其代謝產(chǎn)物以及可

利用的動物。

1）動物細胞培養(yǎng)

2）動物細胞融合

細胞融合是指用人工方法使兩種或兩種以上的體細胞融合并形成…

個細胞，不經(jīng)過有性生殖過程而得到雜種細胞的方法。誘導細胞融合

的方法有生物方法（病毒）、化學方法（PEG）、物理方法（點擊和激

光）等。

3）單克隆抗體技術(shù)

第二章細胞顯微觀測技術(shù)

第一節(jié)細胞顯微技術(shù)

1.雙熒光染色觀察活細胞的細胞核和線粒體

【實驗原理】

一般生物染料不能穿透細胞膜，只有當細胞被固定后改變了細胞膜的通透

性，染料才能進入活細胞，并對細胞不產(chǎn)生毒性作用。熒光染料，Hochest33342

和若丹明123都是活體染料，HO33342能與細胞中的DNA進行特異性結(jié)合，而

羅丹明123能與線粒體進行特異性結(jié)合，采用兩種熒光染料的混合液可對一個活

細胞的細胞核和線粒體同時染色。

【實驗用品】

①材料：口腔黏膜處上皮細胞；

②試劑：熒光染料HO33342,羅丹明123,指甲油。

③設備與工具：熒光顯微鏡，水浴鍋，載玻片，蓋玻片，鏡子，消毒牙簽。

【試劑配制】

雙熒光染液：含0.25ug/mLHO33342和羅丹明123lug/mL的PBS液。

【實驗操作】

①用牙簽在自己的口腔黏膜處刮去上皮細胞涂于干凈的載玻片上。

②滴一滴雙色熒光染液與細胞表面上。

③加上蓋玻片，防止氣泡，用指甲油把蓋玻片的邊緣封閉好。

④用落射式熒光顯微鏡觀察。

【注意事項】

①每種熒光都有最適合的pH值，且此時熒光最強，當染料的pH值改變時，不

僅熒光減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測要在一定pH緩沖液中進行。

②熒光通常在20℃以下比較穩(wěn)定，熒光會隨著溫度的升高出現(xiàn)溫度淬滅。

③在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強而使樣品的熒光很快衰竭，造成觀察和照

相困難。為此，最好能用能量較小的長波長進行觀察,照相時再適當增強激發(fā)光。

④一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一也能使標本著色。在

一定的限度內(nèi)，熒光的強度可能隨熒光素濃度的增加而增強，但超過限度，熒光

強度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使用自身淬滅所致。

【實驗結(jié)果與分析】

先用高倍鏡觀察細胞核(采用紫外線激發(fā)濾片/雙色束分離器/內(nèi)裝阻斷濾片

的組合插塊置于光路)，可見核發(fā)藍色熒光。再換油鏡觀察線粒體(換紫光或藍

光的組合插塊)，在細胞核附近可見有一些發(fā)綠光的圓形和短桿狀顆粒分布，即

為線粒體。

2.碘化丙咤PI的染色濃度為5Ug/mL,PBS配制。

3.Annexin-V檢測細胞早期凋亡

Annexin-V試劑盒是檢測凋亡早期細胞膜損傷的新方法。在凋亡的早期階段，變

化主要發(fā)生在細胞表面。雖然細胞膜的完整性尚還維持，但膜磷脂已失去平衡。

此時位于細胞膜上的磷脂酰絲胺酸(phosphatidylserine,PS)會從細胞膜的內(nèi)側(cè)

翻到外側(cè)，露于細胞外環(huán)境中。而Annexin-V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，

與磷脂具有高度親和力，它可與轉(zhuǎn)移到膜外的PS結(jié)合，從而在，這些早期凋亡

細胞還未出現(xiàn)形態(tài)學改變及DNA降解前，即可以通過Annexin-V熒光染料染色而

檢測到。細胞凋亡早期，可見到僅細胞被染成綠色，在凋亡中期，Annexin-V熒

光染料進一步與胞漿內(nèi)的PS結(jié)合，可見細胞膜及細胞漿被染成綠色。Annexin-V

一般要與碘化丙咤(PI)結(jié)合使用，PI這種核酸染料不能透過完整的細胞膜，但

對于凋亡晚期的細胞和死細胞，PI能夠透膜而使其染紅。因而，Annexin-V與PI

配合使用，能將凋亡與死細胞鑒別開來，并且可以初步確定細胞凋亡的進程。

【實驗用品】

⑴材料懸浮細胞，貼壁細胞

(2)試劑Annexin-V試劑盒,50口g/ml碘化丙喔，結(jié)合緩沖液(lOmmol/LHEPES,

140mmol/LNaCI,5mmol/LCaCI2,pH7.4)。

⑶設備與工具激光掃描聚焦顯微鏡。

【實驗操作】

⑴貼壁細胞樣品的制備

1)取培養(yǎng)于蓋玻片的細胞，加入1ml冰冷的PBS輕輕振蕩漂洗。重復2

次。

2)貼壁輕輕加入200uL結(jié)合緩沖液。

3)介入10口LAnnexin-V-FITC和5HLpI,輕輕混勻,避光室溫反應15min

或4℃反應3min.

4)加入300“L結(jié)合緩沖液，進行激光掃描共聚顯微鏡檢測。

⑵共聚焦顯微檢測根據(jù)細胞大小、密度選擇物鏡(通常20倍或40倍)。Z

軸掃描步距200~1000nm。掃描方式為XYZ。采用三通道檢測，第一通道

激發(fā)光為488nm,檢測發(fā)射光波長為530nm±15nm,偽彩色采用綠色；

第二通道激發(fā)光為488nm或567nm,檢測發(fā)射光波長大于590nm,偽彩色

采用紅色；第三通道采集透射光圖像，偽彩色采用黑-白色。

【實驗結(jié)果與分析】

⑴單染綠色的細胞為凋亡早期的細胞和中期細胞。凋亡的早期，僅細胞膜

被染成綠色。凋亡中期以后,Annexin-V-FITC會進一步與胞漿內(nèi)的PS結(jié)合，

可見到胞膜及胞漿被染成綠色。每個細胞上的綠色斑點大小代表細胞膜

外翻的程度，斑點越大，說明PS外翻約嚴重。

⑵綠、紅雙染或紅色單染為凋亡晚期或死亡的細胞。

⑶綠、紅均未染色，只有光鏡圖像為細胞為未凋亡的正常細胞。

補充：

1.激光掃描共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscopy,LSCM)是在熒光

顯微鏡成像的基礎上加裝掃描裝置，使用紫外線或可見光激發(fā)熒光探針，利

用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像，以

及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的

變化。

(1)LSCM的主要組成部分及工作原理

激光掃描共聚焦顯微鏡組成除光學顯微鏡部分外主要由激光光源、掃描

裝置、檢測器、計算機系統(tǒng)(包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應用軟件)、圖像

輸出設備、光學裝置和共聚焦系統(tǒng)組成。點光源照射樣品產(chǎn)生的激光發(fā)光斑

被探測器以共軻形式接收于焦平面，計算機以像點的方式將被探測點顯示在

計算機屏幕上。為產(chǎn)生一幅完整的圖像，可通過計算機控制的步進電動機帶

動顯微鏡移動，以實現(xiàn)在同-焦平面上的逐點掃描。同樣，也可以通過沿Z

軸方向逐漸改變焦平面來完成對樣品不同層面的掃描。亦即可對細胞或組織

厚片進行類似CT斷層掃描無損傷的光學切片，連續(xù)光學切片經(jīng)過計算機三維

重建的處理，能夠從任意角度觀察標本的三維剖面或整體結(jié)構(gòu)。

激光掃描共聚焦顯微鏡在研究和分析活細胞結(jié)構(gòu)、分子、離子的實時動

態(tài)變化過程以及組織和細胞的連續(xù)光學切片和三維重建等方面。

與光學顯微鏡相比，激光掃描共聚焦顯微鏡具有以下特點：

1)LSCM的圖像是以電信號的形式記錄下來的，所以可以采取各種模擬

的和數(shù)字的電子技術(shù)進行圖像處理；

2)LSCM利用共聚焦系統(tǒng)有效地排除了焦點以外的光信號干擾，提高了

分辨率，顯著改善了視野的廣度和深度，使得無損傷光學切片技術(shù)

成為可能，達到了三維空間定位；

3)由于LSCM能隨時采集和記錄檢測信號，為生命科學開拓了一條觀察

活細胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子生物學變化的新途徑；

4)LSCM除有成像功能外，還具有圖像處理功能和細胞生物學功能，前

者包括光學切片、三維圖像重建、細胞物理和生物學測定、熒光定

量和定位分析以及離子的實時定量測定；后者包括黏附細胞的分選,

家光細胞顯微外科及光陷阱技術(shù)、熒光漂白后恢復技術(shù)等。

4.細胞蛋白質(zhì)總量分析

異硫氟酸熒光素(FITC)是檢測細胞蛋白總量常用的熒光探針，它是酸性

染料，能以共價鍵的方式結(jié)合到蛋白質(zhì)帶正電荷基團上，以藍色激發(fā)光可以發(fā)出

明亮的綠色繼發(fā)熒光，綠色繼發(fā)熒光的強度與細胞蛋白質(zhì)的含量呈正相關。

檢測細胞蛋白的總量可以檢測一個細胞群體的生長和代謝狀態(tài)，也能區(qū)別

蛋白含量不同的樣品。

【實驗用品】

①材料：單細胞懸液(lX10A6j/mL),12mmX75mm的Falon管。

②試劑：FITC染色液，無水乙醇，PBS(pH7.4),70%乙醇(破膜劑)。

③設備與工具混合震蕩器，流式細胞儀，孵箱，離心機。

【試劑配制】

①FITC染色液取20mg異硫氟酸熒光素，加20mL無水乙醇，使FITC充分溶解，

即為染色液的原液，保存于4℃冰箱待用。

②FITC工作液將FITC染色液用pH7.4的PBS液稀釋成50口g/mL濃度的工作液。

【實驗操作】

①細胞懸液中加70%的酒精，破膜lOmin,以800r/min離心，棄破膜劑。

②PBS洗滌細胞，以800r/min收集細胞。

③取FITC工作2mL加入樣品中，混勻，置4℃冰箱中反應30min。

(4)以1500rpm離心，棄工作液。

⑤加0.5mLPBS,混勻，上機檢測。

第三章細胞檢測技術(shù)

第一節(jié)流式細胞儀檢測技術(shù)

流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生

物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時

從一個細胞中測得多個參數(shù)，成為當代最先進的細胞定量分析技術(shù)。

流式細胞術(shù)是在流液束、照明光軸、檢驗系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞

計的基礎上，用熒光Feulgen反應對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存

在著線性關系，并在DNA的直方圖上清楚的顯示出細胞周期的各個時相。

流式細胞術(shù)(Flowcytometry,FCM)用于免疫組化中的關鍵是對細胞進行免疫

熒光染色。

1.流式細胞儀的工作原理和基本操作

（1）儀器構(gòu)造

流式細胞儀主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統(tǒng)；激光源和

光學系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。

1）流動室和液流系統(tǒng)

流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，由光學玻璃、石英等材料制作，

是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管用來儲放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作

用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后

從噴嘴射出。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。

2）激光源和光學系統(tǒng)

經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢

測。常用的光源有弧光燈和激光，激光器以僦離子激光器為主。

為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑

應和細胞直徑相近。因此需要將激光光束經(jīng)透鏡會聚。

為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光信號的信噪比，在

光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通的濾片是有選擇性地使某一波長

區(qū)段的光線濾除或通過。

在免疫分析中常壓要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，這是要

采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。

二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一

特定波長的光線反射。

3）光電管和檢測系統(tǒng)

經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器變

成電信號而進行測量的。

4）計算機和分析系統(tǒng)

經(jīng)放大后的電信號被送往計算機分析器，進行數(shù)據(jù)的儲存、處理和分析，

最后給出結(jié)果。

⑵工作原理

將待測標本制備成單細胞懸液后熒光染色，壓入充滿鞘液的流動室。當鞘液

壓力與樣品流壓力的差異達到一定程度時，鞘液裹挾著樣品流中細胞排成單列逐

個經(jīng)過激光聚焦區(qū)。

標上特異性熒光染料的細胞在通過激光檢測區(qū)時發(fā)出特定波長的熒光，通過

一定波長選擇通透性的濾色片，可將不同波長的散射光、熒光信號區(qū)分開，并送

到不同的光電倍增管中，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)換、放大，數(shù)字化處理，就可以用

計算機直觀地統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞百分率。

選擇不同的熒光染料，就可以利用FCM同時測定一個細胞上多種不同的特

征，即參數(shù)測量；

如果對具有某種特征的細胞有興趣，還可以利用流式細胞儀的分選功能將其

分選出來，以便進一步培養(yǎng)、研究，即樣品分選。

1）參數(shù)測量原理

I.流式細胞儀可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非

熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和

噴出噴孔的流液束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受

到激光照射會向立體角為2Ji的整個空間散射光線，散射光的波長和入攝

光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜

和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關，因為這些生物學參數(shù)又和細胞對光線的反射、

折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散

射，因此可利用不同的散射信號對不經(jīng)染色的活細胞進行分析和分選。

經(jīng)過固定的和染色處理的細胞由于光學性質(zhì)的改變，其散射光信號不同

于活細胞。散射光信號不僅與作為散射中心的細胞參數(shù)相關，還跟散射

角及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。

II.在流式細胞的檢測技術(shù)中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前

向角（即0°角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC）,又稱90°角散射。

這里所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管

軸向方向之間大致所成的角度。-一般說來，前向角散射光的強度與細胞

的大小有關，對同種細胞群體隨著俄細胞截面積的增大而增大；對球形

活細胞，經(jīng)實驗表明，在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小呈線性關

系；對于形狀復雜具有取向性的細胞，則可能差異很大，尤其需要注意。

側(cè)向散射光雖然也能與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質(zhì)、

核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反應。

III.在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒

光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色的細胞。光散射測

量最有效的用途是從非均一的人群中鑒別出某些亞群。

IV.熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒

光分子經(jīng)光照射后發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的

熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不

同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的

分辨和測量。在免疫細胞化學等的測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗

體來說，提高信躁比是關鍵。一般說來，細胞成份中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光

的分子(例如核黃素、細胞色素等)的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)

細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞

的比例越高，自發(fā)熒光越強。

2)樣品的分選原理

流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的?？偟倪^程是：由噴嘴

射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路

判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜

帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其他液體當作作廢液抽

吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。

3)數(shù)據(jù)的顯示與分析

I.數(shù)據(jù)顯示

①FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖(histogram)>二維點圖

(dotplot)>二維等高圖(contour)、假三維圖(pseudo3D)和

列表模式(listmode)等。

②直方圖是一維數(shù)據(jù)用得最多的圖形顯示形式，既可以用于定性分

析，又可以用于定量分析，形同一?般X-Y平面掃描圖儀給出的曲

線。

③二維點圖是能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關系。橫

坐標和縱坐標分別為與細胞有關的兩個獨立參數(shù)，平面上每一個

點表示同時具有相應坐標值的細胞存在。可以由二維點圖得到兩

個一?維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點圖的信息量要大

于兩個i維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細胞具有相同

二維坐標，在圖上只表示一個點，這樣對細胞點密集的地方就難

以顯示它的精細結(jié)構(gòu)。

④二維高等圖類似于地圖上的等高線表示法。它是克服二維點圖的

不足而設置的顯示方法。等高圖中每一條連續(xù)曲線上具有相同的

細胞相對或絕對數(shù)，即“等高二曲線的層次越高所代表的細胞數(shù)

愈多。一般層次所表示的細胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密

集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化越平衡。

⑤假三維圖是利用計算機技術(shù)對二維等高圖的一種視覺直觀的表現(xiàn)

方法。它把原二維圖中的隱坐標——細胞數(shù)同時顯現(xiàn)，但參數(shù)維

圖可以通過旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷

地”的結(jié)構(gòu)和細節(jié)，這無疑有助于對數(shù)據(jù)進行分析。

II.數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析的方法可以分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當被檢測的

生物學系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學模型技術(shù)時多使用參數(shù)方法。數(shù)學模型可

以是一個方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)

據(jù)。而非參數(shù)分析方法對測量得到的分布形狀不需要作任何假設，即

采用無設定參數(shù)分析法。

2.流式細胞術(shù)樣品制備技術(shù)

FCM進行各種參數(shù)分析必須以單細胞為基礎，根據(jù)各種組織成分的特點

應選擇不同的細胞分散方法，以期達到單細胞產(chǎn)量高、損傷少的目的。

實驗證明，酶法與化學法對實體組織的分散解聚較理想，但對所測化學

成分有不良影響。機械法常常造成嚴重的細胞損傷，單細胞產(chǎn)量低?；瘜W處

理方法導致活細胞存活率較低，細胞產(chǎn)量低，細胞碎片和細胞聚集的量不穩(wěn)

定?；瘜W試劑可單獨使用，也可與其他方法結(jié)合使用。

要根據(jù)實驗目的選擇合適的單細胞懸液制備方法，才能還獲得理想的樣

本和好的FCM檢測結(jié)果。

⑴酶消化法

【原理與應用】

酶消化法是將組織和培養(yǎng)細胞分散成為單細胞的主要方法之一。其原理

主要有3個方面：①可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等；②可以水解

組織間的黏多糖等物質(zhì)；③可以水解組織間的緊密連接裝置的蛋白物質(zhì)。

常用的酶試劑有：

蛋白酶類——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶和中性蛋白酶等，都

能解離組織中的細胞；

胰蛋白酶能水解酯鍵和肽鍵；

膠原酶能降解兒種分子類型的膠原；

溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖背鍵；

彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白纖維。

故可根據(jù)分散組織的類型來確定使用的酶類。

【實驗操作】

①將適合于酶消化的組織置于離心管中。

②將選好的2ml酶溶液加入盛有被消化組織的試管中。

③一般消化20~30min（恒溫37c或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹

打。

④終止消化，收集細胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，出去細胞團塊，

以低速離心除去細胞碎片。

⑤將制備好的單細胞懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

【注意事項】

①酶需要溶解于適當?shù)娜芤褐校疫@些溶液不至于造成酶效價降低。

②要注意酶的使用濃度和消化時間。

③要注意酶活性的pH,如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中會失去活性，而胰蛋

白酶在中性環(huán)境中活性不佳。

④要隨時注意酶活性的其他因素，如酶的生產(chǎn)批號等。

⑵機械法

機械法分剪碎法、網(wǎng)搓法和研磨法。機械法易造成細胞碎片或細胞團塊,

所以常需與其他方法配合使用。

【實驗操作】

I.剪碎法

①將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水。

②用剪刀將組織剪至勻漿狀。

③加入10ml生理鹽水。

④用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。

⑤以1000r/min離心沉淀，4~5min,再用生理鹽水洗3次，每次以低速

(500~800r/min)短時離心沉淀去細胞碎片。

⑥以300目尼龍網(wǎng)濾去細胞團塊。

⑦細胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

II.研磨法

①先將組織剪成1~2mm3大小的組織塊。

②放入組織研磨器中加入1~2ml生理鹽水。

③轉(zhuǎn)動研磨棒，研至勻漿。

④加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器。

⑤收集細胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，以500~800r/min離心沉淀，

l-2min,再以生理鹽水洗3次，離心沉淀。

⑥固定或低溫保存細胞懸液，備用。

⑶化學處理法

化學處理法是將組織或細胞間起連接作用的鈣、鎂離子置換出來，從而

使細胞分散開來。

【試劑配制】

①0.2%EDTA溶液稱EDTA0.2g,力H入Hank's液100ml,高壓滅菌。置于0~4℃

保存。

②胰酶-EDTA溶液胰酶0.25g,力口入PBS(pH7.0)200ml。EDTA0.2g加PBS

(pH7.0)100mlo各取40ml混合，分裝，置冰箱保存，用時過濾。

【實驗操作】

I.組織

①將組織切成包薄片，置入試管中。

②首先加入EDTA液5mI,室溫下放置0.5h,離心棄上清液。

③再加入胰酶-EDTA液5mL在37℃恒溫水浴振蕩30min。

④用300目尼龍網(wǎng)過濾，以1000r/min離心沉淀，5min。再以生理鹽水洗

2~3次。

⑤細胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

II.培養(yǎng)細胞

①貼壁培養(yǎng)細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化3~7min。細胞變圓有脫落趨勢

時，棄去胰蛋白酶溶液。加入無鈣、鎂離子的PBS,反復用吸管吹打使細

胞脫落，將細胞移入離心管。

②以1000r/min離心5min,去上清液。加PBS,重復2~3次。

③加PBSO.5mI,振蕩使細胞分散。

④加入-20℃冷乙醇1ml,混勻，再加入-20C冷乙醇適量，調(diào)整細胞濃度為

5~8X10A5個/ml,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

【注意事項】

①對新鮮組織要及時處理保存，以免組織在室溫下放置時間過長而產(chǎn)生中

心組織壞死或細胞自溶，影響FCM結(jié)果。

②根據(jù)實驗目的選擇最佳的固定方法，以免由于固定劑原因，造成FCM檢

測結(jié)果不穩(wěn)定。

③酶法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑、消化時間、pH值、

濃度等方面對酶消化發(fā)的影響。

④要根據(jù)不同組織選擇相應的方法。FCM快速進行各種參數(shù)的分析必須以

單細胞為基礎，為實現(xiàn)單細胞產(chǎn)率高、損傷少的目的，對不同的樣本采

用不同的方法制備單細胞懸液。

III.細胞蛋白質(zhì)總量分析

【原理與應用】

異硫氟酸熒光素（FITC）是檢測細胞蛋白總量最常用的熒光探針。

它是酸性染料?，能以共價鍵方式結(jié)合到蛋白質(zhì)帶正電荷的基團上。以藍

色激光激發(fā)可以發(fā)出明亮的綠色繼發(fā)熒光。綠色繼發(fā)熒光的強度與細胞

的蛋白質(zhì)含量正相關。

測定細胞蛋白總量可以檢測?個細胞群體生長和代謝的狀態(tài)，也能

區(qū)別蛋白含量不同的樣品。

第三節(jié)細胞增殖與凋亡

1.細胞增殖

細胞物質(zhì)儲備和細胞分裂是一個相互連續(xù)的過程，這一過程即稱為細胞增殖

(cellproliferation)o將細胞增殖的循環(huán)過程構(gòu)成了細胞周期(cellcycle),一

個完整的細胞周期包括分裂間期和分裂期。一個細胞周期是一個細胞的整個

生命過程，即一個細胞經(jīng)過生長、準備并最終變成兩個新的細胞。因此，通

過對細胞增殖的研究可以觀察、判斷細胞所處的時期以及生長狀況，也就是

說，對細胞增殖的研究可以通過細胞生長的研究來實現(xiàn)。

⑴MTT檢測細胞生長

【原理與應用】

MTT的化學名稱為甲基曝陛基四哇，商品名為嘎哇藍，可接受氫原子而

發(fā)生顯色反應?；罴毎械木€粒體具有琥珀酸脫氫酶，能夠使外源性的

MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物，而死細胞缺乏線粒體活性，因而無

此活性。藍紫色結(jié)晶可以溶解在二甲基亞碉中，應用酶標儀可以檢測其

吸光值，并根據(jù)吸收值的高低判斷細胞數(shù)量。

【實驗用品】

①材料待測細胞，96孔培養(yǎng)板，槍頭，10ml吸管橡皮頭，小燒杯。

②試劑二甲基亞碉(DMSO),PBS,MTT溶液。

③設備與工具超凈工作臺，C02孵箱，倒置相差顯微鏡，混合振蕩器，水

浴鍋，酶聯(lián)免疫檢測儀，移液器。

【試劑配制】

MTT溶液:稱取250mgMTT,在50ml0.01mmol/lPBS(pH7.4)中溶解，

并用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4℃保存，有效期2周。

【實驗操作】

①取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔中加0.1ml含2X10A3~5X10A4個細胞的培養(yǎng)

液。

②在37℃、5%CO2的飽和水汽C02培養(yǎng)箱中4d,讓細胞貼壁（如果是懸

浮細胞可直接進行下-一步）。

③吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次（如為懸浮細胞，應該吸去上清液前離心

培養(yǎng)板）。

（4）每孔加O.lmIPBS和10口IMTT染液,在37℃5%CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱

中培養(yǎng)4-6ho

⑤將培養(yǎng)液分兩組：一組，小心吸取孔內(nèi)的上清液（對懸浮細胞要離心，

離心后棄上清液），棄去上清液并加入150W的DNSO,振蕩lOmin,使

紫色結(jié)晶溶解；另一組，用0.25%胰酶消化，并用培養(yǎng)基調(diào)整使體積達

到200PI,細胞懸液在計數(shù)板上計數(shù)細胞。

⑥在酶聯(lián)免疫檢測儀上，以檢測波長570nm、參考波長630nm測定各孔

吸光值（OD值），記錄結(jié)果。

【注意事項】

①酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD值僅在適當?shù)募毎麧舛葧r與細胞數(shù)目呈線性關

系。因此，在實驗時，必須將細胞調(diào)整到適當濃度。

②設空白對照。與試驗孔平行設定不加培養(yǎng)基的空白對照孔，其他實驗步

驟保持一致。比色時，以空白孔調(diào)零。

2.細胞凋亡

細胞凋亡（apoptosis）亦稱細胞程序凋亡（programmedcelldeath,PCD）,是

細胞在一系列內(nèi)源性基因的調(diào)控下發(fā)生的自然或生理性死亡過程。

⑴Hoechst33342染色法

【原理與應用】

Hoechst33342為特異性DNA染料,能與A-T鍵結(jié)合，但在pH2.0環(huán)境

則優(yōu)先與RNA結(jié)合，適當調(diào)整染液的pH至7.0,這種染液對死細胞或經(jīng)70%

冷乙醇固定的細胞可立即染色，而活細胞的著色是漸進性的，在10min內(nèi)可

以飽和。

【實驗用品】

①材料?；铙w細胞。

②試劑。Hoechst33342染液,無Ca2+、Mg2+PBS(pH7.2),封片液(pH

5.5)o

③設備與工具。熒光顯微鏡。

【試劑配制】

①Hoechst33342染液。Hoechst33342用雙蒸水配成1mg/mL,pH7.0染色

液。

②封片液(pH5.5)o20mmol/mL檸檬酸，50mmol/mL磷酸氫二鈉，50%甘

油。(是否有成品？)

【實驗操作】

①將Hoechst33342加入培養(yǎng)的細胞中，終濃度為10ug/mL,于37℃孵

育30min。

②4%多聚甲醛和培養(yǎng)液以1:3混合，使多聚甲醛濃度為1%,固定細胞

5~10min.

③固定好后，將細胞懸液涂在載玻片上，并加蓋玻片。

④熒光顯微鏡觀察。熒光顯微鏡激發(fā)濾片選用UV激發(fā)濾片，阻斷濾片為

400~500nmo

【注意事項】

這種染料不溶于磷酸鹽緩沖液，所以配制時必須先以蒸儲水溶解配成儲存液,

在4℃避光保存。如溶液出現(xiàn)絮狀物或沉淀，即不可使用。染色時間不能太

長，否則會有假陽性現(xiàn)象。

【實驗結(jié)果與分析】

在熒光顯微鏡下，活細胞核呈現(xiàn)出彌散、微弱的熒光。出現(xiàn)凋亡時，細胞核

或細胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光(藍色)，并且細胞核形態(tài)也有明

顯變化。如果見到3個或3個以上的DNA的熒光碎片-，則認為是凋亡細胞。

該法是利用凋亡細胞對Hoechst33342攝取增強的特點，由于不同細胞對

Hoechst33342攝取各異，故該法不一定適合所有細胞。

⑵流式細胞儀方法

I.PI染色

【原理與應用】

碘化丙咤(propidiumiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，

但對凋亡晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核呈紅然。

【實驗用品】

①材料細胞，400目篩網(wǎng)。

②試劑PBS溶液，PI染液，70%乙醇。

③設備與工具流式細胞儀。

【試劑配制】

PI染液：將PI溶于PBS(pH7.4)中，中濃度為100ug/mL。用棕色瓶4℃避

光保存。

【實驗操作】

①收集細胞1X10八6個，于500~1000r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。

②用lmlPBS/FSC洗1次。

③以500-1000r/min離心5min去PBS/FCS,力H入500uLPBS/FCS和500nL

的多聚甲醛固定液，輕輕混勻，在4℃下固定4min。

④以500~1000r/min離心5min棄去固定液,室溫加入含0.2%吐溫的PBS1mL,

于37℃孵育15mino

⑤用ImLPBS/FCS洗3次，每次5min。

⑥400目的篩網(wǎng)過濾1次。

⑦以500~1000r/min離心5min去PBS/FCS,用1.0mLPI染液,于4℃避光

保存至少30mino

⑧流式細胞儀檢測：染色在24h之內(nèi)皆可行。PI用僦離子激發(fā)熒光，激光

光波波長為488nm,發(fā)射光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光。分析前

散射光對側(cè)散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。

【注意事項】

細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種

DNA可燃性降低也可能是因為DNA含量降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變

使其與燃料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應該注意。

【實驗結(jié)果與分析】

在前散射光對側(cè)散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比,

前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細胞類型有關。

在分析PI熒光的直方圖時，先排除成雙或聚集的細胞以及法微弱熒光

的細胞碎片。在PI熒光直方圖上，凋亡細胞在G3/G0期前出現(xiàn)一個亞二倍

體峰，如以G3/G0期所在位置的熒光強度為1.0,則一個典型的凋亡細胞樣

本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45?？捎秒u和鞋魚的紅細胞的PI熒光強度作

參照標準，兩者分別為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而

是完整的細胞。

II.Hoechst3334/PI染色

【原理與應用】

流式細胞儀通常根據(jù)細胞完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”，正

常細胞和凋亡細胞可歸為活細胞?；罴毎玖先鏗oechst33342能少許進入正

常細胞膜，對細胞也沒有太大毒性作用。Hoechst33342在凋亡細胞中熒光強

度要比正常細胞中的高，它在凋亡細胞中熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜

通透性發(fā)生改變有關。凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變，但細

胞膜的通透性已有增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst33342比正常的細胞

多。此外，凋亡細胞的染色體DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而使該染料能更有效

地與DNA結(jié)合。凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷，不能有效地將

Hoechst33342排除細胞外，因而使之在細胞內(nèi)積累增加。

Hoechst33342進入凋亡細胞要比正常細胞容易，而EB、PI或7-AAD等

染料不能進入細胞膜完整的活細胞中。正常細胞和凋亡細胞在不經(jīng)固定的情

況下對EB、PI、7-AAD等染料拒染，壞死細胞由于膜完整性在早期已破損，

可被這些染料染色。根據(jù)這些特性用Hoechst33342結(jié)合PI或EB等染料對凋

亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和死亡細胞

區(qū)分開來。

【實驗用品】

①材料細胞，400目篩網(wǎng)。

②試劑Hoechst33342染，PI染液。

③設備與工具流式細胞儀。

【試劑配制】

①Hoechst33342染液用PBS配成10ug/mL的儲存液，于4℃避光保存。

②PI染液用PBS配成5Ng/mL溶液，于4℃避光保存。

【實驗操作】

①懸浮生長細胞在培養(yǎng)狀態(tài)下加入Hoechst33342,終濃度為1口g/mL；貼

壁生長的細胞用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化成單細胞懸液，離心，

棄上清液，用1mL全培養(yǎng)液重懸細胞，加入Hoechst33342,終濃度為1

Ug/mL,于37℃孵育7~10mino

②于4℃低溫500~1000r/min離心5min,棄去染液。

③加入1.0mLPI染液，于4℃避光染色15min。

④400目的篩網(wǎng)過濾1次。

⑤流式細胞儀分析：Hoechst33342用氟激光激發(fā)紫外線熒光，激發(fā)光波波

長為352nm,發(fā)射光波波長為400~500nm,產(chǎn)生藍色熒光；PI用顯激光

激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm,發(fā)射光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅

色熒光。分析藍色熒光對紅色熒光散點圖或地形圖。

【注意事項】

①在紅色熒光對藍色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷

移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。

②用Hoechst33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min

內(nèi)，如果時間太長可引起Hoechst33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光遷移，

導致紅色熒光與藍色熒光的比例改變，從而影響實驗結(jié)果。

【實驗結(jié)果分析】

正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoechst

染料］雖然呈現(xiàn)強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙咤(PI)而呈強紅

色熒光。在藍色熒光對紅色熒光的散點圖上，這三群細胞表現(xiàn)分別為：正常

細胞為低藍色/低紅色熒光(Hoechst33342+/PI+),凋亡細胞為高藍色/低紅色

(Hoechst33342++/PI+),死亡細胞為高藍色熒光/高紅色熒光(Hoechst

33342++/PI++)o

第四章細胞的培養(yǎng)與分離

第一節(jié)細胞培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)

1.細胞的原代培養(yǎng)

細胞的原代培養(yǎng)（primaryculture）或初代培養(yǎng)是指從供體直接分離的組

織細胞的首次培養(yǎng)。原代細胞離體時間段，具有二倍體遺傳性，在一定程

度上能反應其在體內(nèi)的生長特性，適合于進行藥物測試、細胞分化和轉(zhuǎn)化

等實驗研究。在臨床研究中，短期原代培養(yǎng)細胞的移植療效明顯高于未經(jīng)

培養(yǎng)的組織細胞。因此體外培養(yǎng)人的各種組織細胞，尤其是上皮細胞，對

于研究各種疾病的發(fā)生。發(fā)展及防治都具有重要意義。根據(jù)實驗目的以及

實驗材料的不同，分離及培養(yǎng)細胞的方法和條件各有不同。

一般常用方法有兩種：一是組織塊培養(yǎng)法；一是消化培養(yǎng)法。

（1）組織塊培養(yǎng)法

【原理與應用】

組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡便并且成功率較高的原代培養(yǎng)方法，即將組

織剪切成小塊后，直接接種于培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細胞生長需要作相

應處理。例如為了利于上皮細胞等細胞的生長，可以在生長面預先涂上膠原

薄層。如果原代細胞準備做組織染色記憶電鏡等進一步檢查，可在原代培養(yǎng)

之前先在培養(yǎng)瓶內(nèi)放置清洗干凈的蓋玻片。并在放入組織塊前預先用1~2滴

培養(yǎng)液濕潤瓶底，使蓋玻片固定在瓶底。組織塊培養(yǎng)法操作簡便，部分種類

的組織細胞在小塊貼壁培養(yǎng)24h后，就有細胞從組織塊四周游出。但由于在

你反復剪切和接種過程中對組織塊的損傷，并不是每個組織都能長出細胞，

只適合于組織量少的原代培養(yǎng)，如牙髓細胞培養(yǎng)等。

【實驗用品】

①材料泡沫塑料板或木