公開課用土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)省公開課一等獎全國示范課微課金獎課件

課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與記數(shù)1/251、了解尿素

尿素是一個由C、H、O、N組成有機化合物，分子式為CO(NH2)2，它是動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，在肝臟中合成后，隨尿液排出。

1828年，德國化學家維勒成功經(jīng)過無機物化學反應合成了尿素。今后，尿素走向工業(yè)化并廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。課題背景2/25課題背景尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中一些細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、尿素利用3、細菌能分解尿素原因直接原因：能合成脲酶（分解尿素酶）根本原因：含有合成脲酶相關基因3/25兩個主要目標：（1）從土壤中分離出能夠分解尿素細菌；（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中終究含有多少這么細菌。課題目標4/25

科學實例：尋找耐高溫DNA聚合酶說明：尋找目標菌種時要依據(jù)它對生存環(huán)境要求，到對應環(huán)境中去尋找。篩選原因：因為熱泉高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱Taq細菌保留下來。DNA多聚酶鏈式反應(PCR)是一個在體外將少許DNA大量復制技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）DNA聚合酶。1966年，布魯克在美國黃石國家公園一個熱泉中發(fā)覺了耐熱Taq細菌，并分離到耐高溫DNA聚合酶。一、篩選菌株耐高溫酶耐高溫生物體耐高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找5/252、方法：

試驗室怎樣篩選菌種人為提供有利于目標菌株生長條件(包含營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其它微生物生長。1、原理：使用選擇培養(yǎng)基：允許特定種類微生物生長，同時抑制或阻止其它種類微生物生長培養(yǎng)基。依據(jù)原理，培養(yǎng)基應怎樣配制，才能將分解尿素細菌分離出來？利用以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基進行篩選6/251、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌株數(shù)目：統(tǒng)計每克土壤樣品中終究含有多少細菌不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌計數(shù)；個體小細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點7/252.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成一個菌落是由一個單細胞繁殖而成，即一個菌落代表原先一個單細胞。平板劃線法得到菌落稀釋涂布平板法得到菌落8/25使用稀釋涂布平板法接種，在稀釋度足夠高培養(yǎng)基中，細菌比較分散，輕易形成單個菌落。

一個菌落起源于樣品稀釋液中一個活菌

間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）統(tǒng)計菌落數(shù)目每克樣品中菌株數(shù)=（C÷V)×MC:某一稀釋度下平板上生長平均菌落數(shù)；V:所用稀釋液體積；M:稀釋倍數(shù)。9/25

注意事項①為了確保結(jié)果準確，普通選擇菌落數(shù)在30——300平板上進行計數(shù)。稀釋度是不是越高越好？假如稀釋度過高，菌落數(shù)少于30，計算結(jié)果偏低，誤差大；假如稀釋度過低，菌落數(shù)超出300，統(tǒng)計和計算結(jié)果都會有誤差；②恰當稀釋度是成功統(tǒng)計菌落數(shù)目標關鍵。10/25

兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中細菌數(shù)。從對應稀釋倍數(shù)為106培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計菌落數(shù)為230。

2、乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數(shù)平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。

你認為這兩位同學作法正確嗎？假如有問題，錯在哪？

甲：沒有重復試驗（最少涂布3個平板）

乙：其中一個平板計數(shù)結(jié)果與其它兩個相差太大，操作過程可能出現(xiàn)了錯誤。資料分析：11/25注意事項③為增強試驗說服力與準確性，設計試驗時，需要涂布最少三個平板作為重復組。④分析試驗結(jié)果時，要考慮重復組結(jié)果是否靠近，假如相差太大，意味著操作有誤，需重新試驗。⑤為預防培養(yǎng)時間不足造成菌落遺漏，在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)，選取菌落數(shù)穩(wěn)定時統(tǒng)計作為結(jié)果。⑥統(tǒng)計菌落數(shù)往往比活菌實際數(shù)目低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，繁殖后形成還是一個菌落12/25計數(shù)法直接計數(shù)法、平板計數(shù)法、比濁法、膜過濾法13/25三、設置對照1、目標：排除試驗組中非測試原因?qū)υ囼灲Y(jié)果影響，提升試驗結(jié)果可信度。對照試驗是指除了

被測試

條件外，其它條件都

相同

試驗。14/25

利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌分離過程中，從對應稀釋倍數(shù)為106培養(yǎng)基中，A、B兩同學分別得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1、A同學篩選出150個菌落。

2、B同學篩選出50個菌落。B認為A培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其它含氮物質(zhì)，因而造成不能分解尿素細菌也能在該培養(yǎng)基中生長。A確認自己操作無誤，不一樣原因是自己所用土壤樣品與其它同學不一樣，但因為自己在試驗時未設置對照，所以也拿不出能令人信服證據(jù)。請你幫助A同學改進試驗，提供含有說明了證據(jù)。資料分析：15/25小結(jié)：經(jīng)過這個事例能夠看出，試驗結(jié)果要有說服力，對照設置是必不可少。方案一：由其它同學用與A同學相同土樣進行試驗方案二：將A同學配制培養(yǎng)基在不加土樣情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證實培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預測：假如結(jié)果與A同學一致，則證實是土樣不一樣引發(fā)；假如結(jié)果不一樣，則證實A同學操作有誤。土樣不一樣操作有誤造成培養(yǎng)基被污染16/25二.試驗詳細操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好信封中。◆取土樣用小鐵鏟和盛土樣信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源選擇培養(yǎng)基。17/25◆應在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液過程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不一樣微生物采取不一樣稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不一樣目標：保證取得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)平板[三]樣品稀釋18/25為何分離不一樣微生物要采取不一樣稀釋度？測定土壤中細菌總量和測定土壤中能分解尿素細菌數(shù)量，選取稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物數(shù)量（單位：株/kg）是不一樣。比如在干旱土壤中上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結(jié)論：為取得不一樣類型微生物，就需要按不一樣稀釋度進行分離，同時還應該有針對性地提供選擇培養(yǎng)條件。19/25㈣.取樣涂布◆試驗時要對培養(yǎng)皿作好標識。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆假如得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落計數(shù)，假如同一稀釋倍數(shù)三個重復菌落數(shù)相差較大，表明試驗不準確，需要重新試驗。20/25㈤.微生物培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)不一樣微生物往往需要不一樣培養(yǎng)溫度。細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃溫度下培養(yǎng)3～4d。21/25微生物培養(yǎng)與觀察22/25在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時統(tǒng)計作為結(jié)果，以預防因培養(yǎng)時間不足而造成遺漏菌落數(shù)目。23/25利用尿素作為唯一氮源培養(yǎng)基分離出微生物都是能分解尿素微生物嗎？思索：

不一定。因為有些微生物能夠利用其它微生物代謝產(chǎn)物進行生長繁殖。24/25課題