2018微生物檢驗技術(shù)師考點

1.儀器的標(biāo)識管理：紅（停用）黃（準(zhǔn)用）綠（合格）各自所表

明的狀態(tài)。

2.分光光度計檢測細(xì)菌濃度用可見光分光光度計，測細(xì)菌波長用

600nmo檢測蛋白用紫外分光光度計（波長用280nm）,它

也可測核酸濃度（波長260nm）o選定分光光度計測定顏色反應(yīng)

光的波長是450nm。石英比色皿用于紫外分光光度計，玻璃比色

皿用于可見光分光光度計。

3.紫外透射儀該儀器使用條件是暗室和紫外線，主要用于

在紫外線下看DNA條帶。

4.色譜氣相色譜可做微生物分類和鑒定，用于微生物的化學(xué)成

分分析。液相色譜儀也可做微生物化學(xué)成分分析。質(zhì)譜儀也可做微生

物化學(xué)成分分析。

5.測序儀蛋白測序儀測定氨基酸排列順序，DNA測序儀是測

核昔酸排列順序。能做DNA測序的物質(zhì)是質(zhì)粒、噬菌體、PCR產(chǎn)

物。

6.擴(kuò)增儀PCR是聚合酶鏈反應(yīng)縮寫，能做PCR稱DN

A擴(kuò)增儀。它能以一定DNA片段為模板，變換溫度，擴(kuò)增該片段。

常用的“槍”是實驗室常用的微量可調(diào)移液器。

7.酶標(biāo)做ELISA的儀器稱酶標(biāo)儀，做EUSA反應(yīng)，其中

主要設(shè)備有塑料凹孔板、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。

8.電泳類別醋酸纖維膜電泳可用于免疫球蛋白鑒定，瓊脂免

疫電泳用于蛋白分離和鑒定，對流免疫電泳可測抗原或抗體，火箭電

1

泳測抗原量，交叉定量免疫電泳測抗原量。IFE是等電聚焦電泳。

PFGE是脈沖電場凝膠電泳，PAGE是聚丙烯酰胺凝膠電泳。

9.PAGE用于蛋白和核酸分離，原理是凝膠介質(zhì)形成立體

多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩和電泳作用。分離條帶上邊是大分子，下

邊是小分子物質(zhì)。過硫酸鏤在PAGE制備起催化聚合作用。SDS

-PAGE是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，它用于蛋白分離,

在此電泳中，丙烯酰胺濃度越大，線性分離范圍越??；該物濃度越小，

線性分離范圍越大，十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白做

標(biāo)識測驗電泳條帶分子量。在SDS-PAGE中常用蛋白染料是考

馬斯亮藍(lán)，硝酸銀也是其常用染料。該電泳中緩沖液重要成分為甘氨

酸。

10、等電聚焦電泳其原理是以兩性電解質(zhì)制造凝膠有不同P

H,使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點停留。兩性電解

質(zhì)是制備該電泳凝膠不同PH重要物質(zhì)，用聚丙烯酰胺制備等電聚焦

電泳凝膠。這種電泳主要用于蛋白質(zhì)分離。

11、脈沖電泳脈沖電泳用于核酸分離，其優(yōu)點是分離大片段

核酸。用瓊脂糖制備該電泳凝膠的介質(zhì)。這種電泳的電場為正交的交

變脈沖電場。脈沖電場凝膠電泳條帶靠近負(fù)極為大片段DNA,靠近

正極為小片段DNA。DNA染色可用浪化乙錠，也可用硝酸銀。因

澳化乙錠有致癌作用，故在使用時應(yīng)注意。丙烯酰胺具有神經(jīng)毒，在

用時注意個人防護(hù)。

12、瓊脂糖凝膠電泳此電泳用于核酸分離與純化，用水平電

2

泳槽。分離DNA片段最佳范圍為200bp?50kb。

13、聚丙烯酰胺電泳該電泳通常用垂直電泳槽，分離DNA片

段是最佳范圍是5?500bpo

14.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB19489—2004《實驗室生物安全

通用要求》根據(jù)生物因子對個體和群體的危害程度將其分為4級：

危害等級I（低個體危害，低群體危害）不會導(dǎo)致健康工作者和

動物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。

危害等級H（中等個體危害，有限群體危害）能引起人或動物發(fā)

病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴(yán)重危

害的病原體。實驗室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施,

并且傳播風(fēng)險有限。

危害等級m（高個體危害，低群體危害）能引起人或動物嚴(yán)重疾

病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播,

或能用抗生素抗寄生蟲藥治療的病原體。

危害等級IV（高個體危害，高群體危害）能引起人或動物非常嚴(yán)

重的疾病，一般不能治愈，容易直接、間接或因偶然接觸在人與人,

或動物與人，或人與動物，或動物與動物之間傳播的病原體。

15.保存的病原微生物菌（毒）種要按規(guī)定進(jìn)行登記、上報和

核準(zhǔn)，實行雙人雙鎖管理和使用審批制度。保存和使用各類病原

微生物菌（毒）種的實驗室，應(yīng)具備相應(yīng)的實驗室設(shè)備和設(shè)施條件,

并在二級以上生物安全柜中操作。細(xì)菌實驗室在污染情況超過許可程

度時，通常采取甲醛熏蒸消毒。

3

病毒篇

1.用于病毒分離的材料，無論是傳代病毒培養(yǎng)物，還是采自發(fā)病

或死亡動物的病料，都應(yīng)盡快送往實驗室作病毒分離或鑒定。組織細(xì)

胞或動物接種和傳代可以應(yīng)用于病毒的分離和鑒定。病毒對細(xì)胞的感

染性具嚴(yán)格的選擇性和特異性，因此用組織培養(yǎng)細(xì)胞接種病毒必須首

先選擇敏感細(xì)胞。

(1)病毒增殖的判定：病毒在實驗動物體和組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增

殖，顯然都會影響機(jī)體和細(xì)胞的代謝和生命活動，并且經(jīng)常通過一定

的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)變化表現(xiàn)出來。

(2)細(xì)胞病變(CPE)：大部分病毒在敏感細(xì)胞系均可出現(xiàn)CPE,

CPE可以表現(xiàn)為嚴(yán)重的細(xì)胞破壞、細(xì)胞腫大、顆粒增多、細(xì)胞融合成

合胞體或無明顯的細(xì)胞變化等。CPE經(jīng)常具有病毒“種”的特性，因

此常常作為病毒鑒定的依據(jù)之一。

(3)病毒蝕斑(又稱空斑)技術(shù)：病毒蝕斑是指病毒在已長成

的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的純化或病毒懸液中

感染病毒含量的測定。

(4)病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有兩種方法，

一種方法是用實驗動物測定LD50(半數(shù)致死量)，另一種方法是在組

織細(xì)胞上測定TCID50(半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量)。

(5)病毒的保存：分離或鑒定后的病毒經(jīng)過冷凍干燥后可以長

期保存。

4

2.病毒形態(tài)學(xué)檢查快速有效的標(biāo)本制作技術(shù)故然重要，但

更需要識別病毒結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗。病毒形態(tài)學(xué)檢查方法主要有：

(1)光學(xué)顯微鏡僅用于大病毒顆粒(如痘類病毒)和病毒

包涵體的檢查。

(2)電子顯微鏡檢查法

(3)超過濾法用不同孔徑的火棉膠濾膜過濾病毒懸液，將

獲得的濾液接種于組織細(xì)胞、實驗動物或雞胚，或用血凝試驗來測定

病毒是否通過濾膜，從而估計病毒的大小。

(4)超速離心法根據(jù)病毒大小的不同，其沉降速度也不同。

可用超速離心法測得病毒的沉降系數(shù)(S),借以計算病毒的大小。

(5)X線晶體衍射法但標(biāo)本必須為結(jié)晶，可用于無包膜病毒

的研究。

3.免疫學(xué)鑒定

4.病毒的分子生物學(xué)鑒定分子生物學(xué)診斷的特異性取決于

核酸序列的特異性，病毒的分子生物學(xué)鑒定，包括對病毒核酸和蛋白

質(zhì)的測定。核酸測定主要使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、探針技術(shù)和核

酸序列測定，檢測病毒基因組中的特征性區(qū)段甚至整個病毒基因組;

而蛋白質(zhì)測定可使用免疫測定技術(shù)、電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，檢測病毒

特異的蛋白質(zhì)成分。

實驗動物、雞胚以及體外培養(yǎng)的器官和細(xì)胞都可以作為人工增

5

殖病毒的基本工具。而大量病毒的培養(yǎng)，又是病毒學(xué)實驗研究以及制

備疫苗和特異性診斷試劑的先決條件。

1.組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要求比較嚴(yán)格，要用硫酸和

重酪酸鉀溶液浸泡后再清洗應(yīng)用。常用的人工綜合營養(yǎng)液為MEM和

RPMH640。用人工綜合營養(yǎng)液配制細(xì)胞生長液時需要加入適量血清和

谷氨酰胺溶液，還需要加入規(guī)定量的抗生素溶液防止細(xì)菌污染，加人

碳酸氫鈉溶液修正pH,根據(jù)情況還可加入HEPES溶液可使生長液具

有較強(qiáng)的pH緩沖能力。能使組織和成片細(xì)胞分散成單個細(xì)胞的化學(xué)

制劑為胰蛋白酶和EDTA,EDTA使用液又可稱之為Versen溶液，其分

散細(xì)胞的作用原理是EDTA可以結(jié)合鈣、鎂離子，使組織細(xì)胞分散。

動物血清中具有細(xì)胞生長所必需的各種營養(yǎng)因子，它能促進(jìn)細(xì)胞的貼

壁和生長，且有很強(qiáng)的酸堿緩沖能力。細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)過程中

可分為細(xì)胞生長液和細(xì)胞維持液兩種。生長液是使細(xì)胞發(fā)育增殖的液

體，因此要求營養(yǎng)條件豐厚；維持液用于延緩細(xì)胞代謝，從而延長細(xì)

胞的存活時間，以利于實驗的進(jìn)行。這兩種液體成分的主要區(qū)別是血

清含量不同。細(xì)胞生長適宜的pH范圍是pH7.2?7.6。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

全過程的關(guān)鍵是防止污染。

2.細(xì)胞株的保存二甲基亞碉是細(xì)胞低溫保存的良好的保護(hù)劑,

含10%二甲基亞颯的血清可以作為懸浮細(xì)胞的液體在液氮中保存細(xì)

胞。

3.病毒學(xué)上常用的細(xì)胞類型可分為原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和

傳代細(xì)胞三大類，原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)的根本區(qū)別在于細(xì)胞

6

是否能在體外無限傳代。

4.細(xì)胞的純化細(xì)胞的純化可以用細(xì)胞克隆技術(shù)?？寺∈?/p>

指用無性繁殖方法產(chǎn)生的一組遺傳上相同的細(xì)胞和生物群體的過程。

分子雜交，常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時多選用硝酸纖維素濾膜

作為固相支持體。

(1)Southern雜交被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。

(2)Northern雜交被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)包括三個基本步驟，即：模板DNA的

變性、模板DNA與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。

PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、DNA聚合酶、

dNTP、模板DNA、Mg2+O

1、引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取

決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至

10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,

G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的喋

吟或口密咤核甘酸的成串排列。

7

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'

端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要

求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴(kuò)增的靶序列最好有適

宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同

源性。

引物量:每條引物的濃度0.1?lumol或10?lOOpmol,以最低

引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。

2、酶目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿

菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型

的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時），濃度過高可

引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

3、dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP

粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，

在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50—200umol/L,

4、模板模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)

節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)

本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜

蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合

而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，

8

再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙

醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測

標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色

體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采

用異硫氧酸胭或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。

5、Mg2+濃度

Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反

應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg中濃度為1.5?衣Ommol/L

為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低

會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

基因芯片也稱為基因微陣列技術(shù)，指采用原位合成或顯微打印手

段，將數(shù)以萬計的靶基因或寡核昔酸片段固化于支持物表面上，產(chǎn)生

探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過監(jiān)測雜交信號來實現(xiàn)對

生物樣品進(jìn)行快速、并行、高效檢測或醫(yī)學(xué)診斷?；蛭㈥嚵屑夹g(shù)主

要包括四個基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品的準(zhǔn)備和標(biāo)記、生

物分子反應(yīng)和信號的檢測及數(shù)據(jù)分析處理。

雖然基因芯片技術(shù)在微生物診斷中存在一定的不足，但還存在很

大的應(yīng)用前景，其在微生物診斷中，具有以下優(yōu)越性：1）高通量，

可以同時對多種微生物進(jìn)行監(jiān)控。2）多條探針的分子雜交，可以有

效的克服PCR易被污染的特點，從而提高了特異性。3）可以克服窗

口期漏檢情況的發(fā)生。特別是將其應(yīng)用于對幾種微生物的多重感染的

9

診斷上，和鑒定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鑒定中發(fā)揮了

很大的作用。

一、DNA的復(fù)制和修復(fù)細(xì)胞每分裂一次，染色體DNA就合成

一次。DNA分子拆開成兩條鏈，每一條單鏈按照堿基配對的原則合成

另一條新單鏈，成為半保留復(fù)制。在體內(nèi)DNA復(fù)制時必須有RNA引物。

二、轉(zhuǎn)錄在生物體內(nèi)，DNA指導(dǎo)的RNA合成過程稱為轉(zhuǎn)錄。

它是按照儲存在DNA上遺傳信息合成。合成RNA時DNA雙鏈也要解旋,

解旋部位稱啟動子。

三、翻譯在合成各種不同RNA中，tRNA具有搬運氨基酸功能。

構(gòu)成核糖體骨架的是rRNA,而mRNA直接決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。4種核

甘酸排列組成遺傳信息，合成蛋白質(zhì)時轉(zhuǎn)換成20種氨基酸的排列順

序，遺傳信息的這種轉(zhuǎn)換稱為翻譯。3個核甘酸排列順序代表一種氨

基酸密碼，表示蛋白質(zhì)合成開始的密碼有一種，DNA三個終止密碼子

分別是UAA、UAG、UGAo在細(xì)菌里，依靠rRNA和mRNA之間一段互補(bǔ)

序列能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成開始的位置。原核生物核糖體是由16SrRNA、

23SrRNA和5SrRNA組成。在真核生物核糖體的五種主要的組蛋白中，

H1在進(jìn)化中最不保守。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限

制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈

DNAo它可分為三類，其中II類限制性內(nèi)切酶在分子克隆和微生物鑒

定中得到了廣泛應(yīng)用。絕大多數(shù)II類限制酶識別長度為4或6個核昔

酸的回文對稱特異核甘酸序列。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后.產(chǎn)生許

10

多一定長度的片段，使用電泳的方法分離不同長度的片段，一種DNA

結(jié)構(gòu)就能形成一種特征性的圖形，稱為DNA的電泳圖譜。

瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可

分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在

強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。

聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5?500bp)效果較好，其分辨力極

高，甚至相差I(lǐng)bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠通常采用垂

直裝置進(jìn)行電泳。

電泳完畢后，使用濱化乙咤染色，DNA片段聚集的地方，在紫外

光下可以顯示發(fā)橙色熒光的條帶。如果電泳中使用了已知大小的DNA

片段作為分子量標(biāo)志，可以測量并計算出每一DNA片段的長度。結(jié)合

使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析將這些片段排列起來，便可作

出DNA的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜。

DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位

置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。

分子生物學(xué)基本技術(shù)知識點一一質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定

質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從「200kb不等，為

雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主

要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，

能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒

的存在使宿主具有一些額外的特性，如致病的能力和對抗生素的抗性

11

細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的

方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;

分離和純化質(zhì)粒DNA。

抗體檢測知識點一一抗體檢測方法

（一）中和反應(yīng)中和反應(yīng)不僅測定抗體是否存在，而且測

定抗體是否具有免疫保護(hù)作用，因而，盡管這種方法復(fù)雜費時，影響

因素眾多而且不穩(wěn)定，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是病毒性疾病中，仍然是

不可取代的抗體檢測方法。中和試驗的基本方法是，將待檢物質(zhì)

與活的致病微生物混合，感染實驗動物或敏感的細(xì)胞，然后觀察實驗

動物是否發(fā)病、死亡，或細(xì)胞是否發(fā)生病變。在結(jié)果的解釋中應(yīng)當(dāng)注

意，細(xì)胞的中和試驗通常只反應(yīng)抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力，這只

是病毒致病過程中的一小部分。

（二）沉淀反應(yīng)血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可

溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。該類

反應(yīng)可檢測到20?2mg/ml水平的抗體。較常用的檢測方法有：

1.單向免疫擴(kuò)散將一定量已知抗原混于瓊脂中制成瓊脂板,

在適當(dāng)位置打孔后將抗體加入孔中擴(kuò)散，抗原抗體在擴(kuò)散過程中形成

以抗體孔為中心的沉淀環(huán)，可用于檢測血清中的IgG、IgM、IgA和補(bǔ)

體C3等的含量。

12

2.雙向免疫擴(kuò)散將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠中，二者

自由向四周擴(kuò)散，在相遇處形成沉淀線?？捎糜诳贵w的定性、定量檢

測。

（三）凝集反應(yīng)細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合

后形成凝集團(tuán)塊，這一類反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)。

1.直接凝集將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)

細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。檢測方法有兩種：一是玻片凝集試驗，用于

定性測抗原，多用于快速診斷；二是試管凝集試驗，在試管種系列稀

釋待檢血清，加入已知顆?？乖ㄋ谰蚧罹?，多用死菌），進(jìn)行的

血清反應(yīng)，用于定量檢測抗體。溫箱中放24小時后取出反應(yīng)管在室

溫放2個小時再判斷為宜，判定凝集滴度以凝集程度為++而定。

2.間接凝集將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表明，

與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象。

（四）補(bǔ)體參加的反應(yīng)利用抗體與紅細(xì)胞上的抗原結(jié)合，激

活反應(yīng)體系中的補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶解，用溶血現(xiàn)象作為指示系統(tǒng)

幫助結(jié)果判定。常用的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗和溶血空斑試驗。

（五）用標(biāo)記抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)

利用熒光素、酶或放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行

的抗原抗體反應(yīng)。靈敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等優(yōu)點。

1.免疫熒光將已知細(xì)菌、感染病毒的細(xì)胞等顆?？乖裙潭ㄓ?/p>

載玻片，加待檢血清反應(yīng)后，再加熒光素標(biāo)記的抗抗體，置熒光

顯微鏡下觀察判定，用于檢測抗體。

13

2.酶免疫測定是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)?？?/p>

用目測定性，也可用酶標(biāo)測定儀測定光密度（0D）值以反應(yīng)抗體

的含量，敏感度可達(dá)ng/ml甚至pg/mlo常用于標(biāo)記的酶有辣根

過氧化物酶、堿性磷酸酶等。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗（EUSA）。

采用雙抗體夾心法或間接法檢測特異抗體。

3.放射免疫測定法用放射性的核素（1251和1311）標(biāo)記抗

原，檢測抗體，靈敏度達(dá)pg/ml。

4.免疫印跡法將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳區(qū)分的

蛋白質(zhì)抗原轉(zhuǎn)移置NC或PVDF等膜上。檢測特異的抗體。用該法

檢測血清HIV抗體為診斷HIV感染的方法之一。

細(xì)胞免疫檢驗知識點一一淋巴細(xì)胞的分離與類型鑒定體外檢測

淋巴細(xì)胞，需要先制備外周血單個核細(xì)胞（PBMc）,制備PBMC常用的

方法是葡聚糖一泛影葡胺（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。以下

方法通過檢測淋巴細(xì)胞的某些表面標(biāo)志，可確定細(xì)胞的不同類型。

1.免疫熒光法2.磁珠分離法3.陶選法4.流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞免疫檢驗知識點一一免疫細(xì)胞功能測定

（一）T細(xì)胞功能測定

1.T細(xì)胞增殖試驗

2.細(xì)胞毒試驗（1）51Cr釋放法（2）乳酸脫氫酶釋放法

（3）皮膚試驗：根據(jù)局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度檢測。

14

常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素等。

(二)B細(xì)胞功能測定1.B細(xì)胞增殖試驗B細(xì)胞受絲裂原刺

激后，進(jìn)行分裂增殖，溫育一定時間后檢查抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。

2.抗體形成細(xì)胞測定常用的溶血空斑試驗測定。將-SRBC、待檢

B細(xì)胞、補(bǔ)體及適量瓊脂糖液混合，傾斜平皿，溫育1?3小時后，

肉眼觀測分散的溶血空斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個抗體形成細(xì)胞,

空斑的數(shù)量即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。

常用儀器知識點一一生物培養(yǎng)類

1.普通培養(yǎng)箱分為隔水式和直熱式兩種，隔水式培養(yǎng)箱采用

浸入式電熱管隔水加溫，箱內(nèi)各部溫度恒定均勻，為實驗室首選；直

熱式培養(yǎng)箱是以電爐絲直接加熱，箱內(nèi)上下層溫度相差較大，指示用

溫度計不能真實指示底層溫度。

用途：用于普通需氧和兼性厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)。當(dāng)室溫低時，也可用于

真菌培養(yǎng)。但細(xì)菌和真菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用時注意事項：

(1)箱體必須有效接地，避免將水濺在內(nèi)層玻璃門上，以防玻璃受

驟冷而爆裂。

(2)隔水式培養(yǎng)箱在通電前，一定要先加水(以蒸儲水或去離子水

為宜)，否則會燒壞電熱管，經(jīng)常觀察水位指示浮標(biāo)，水位不足時，

及時補(bǔ)足水量。

(3)箱內(nèi)的培養(yǎng)物不宜放置過擠.以利冷熱空氣對流不受阻塞，保

持箱內(nèi)溫度均勻。培養(yǎng)時，打開箱體頂部的通風(fēng)口，避免箱內(nèi)濕度過

15

大。

(4)如箱內(nèi)溫度不穩(wěn)定，可檢查溫度控制器的接點或請專人檢修。

(5)使用時應(yīng)早晚觀測箱內(nèi)溫度各一次，每次觀測后記錄箱內(nèi)實際

溫度。

(5)培養(yǎng)箱使用后要定期消毒，以免交叉污染，影響檢測結(jié)果。

2.真菌培養(yǎng)箱是氣溫過高地區(qū)培養(yǎng)霉菌和酵母菌的必備設(shè)備。

配有加熱、制冷、加濕、消毒系統(tǒng)，可自動調(diào)節(jié)溫度，控制濕度、定

時消毒、自動換氣等。當(dāng)室溫高于35c時-，也可用于培養(yǎng)細(xì)菌。但

真菌和細(xì)菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用時注意事項：

(1)接通電源后，打開開關(guān)，設(shè)定溫度，并用測量開關(guān)測量箱內(nèi)實

際溫度。

(2)開機(jī)一段時間后加熱和制冷兩燈均不亮，表示箱內(nèi)溫度達(dá)到平

衡；如兩燈同時亮，表示機(jī)器故障，須請專業(yè)人員檢修。

(3)在箱內(nèi)取放物品時，切勿碰撞探頭，以免影響靈敏度。

(4)在制冷裝置啟動時，如有異常聲音，應(yīng)立即停機(jī)檢修。

(5)儀器使用時應(yīng)每天兩次(早、晚各一次)觀測記錄箱內(nèi)實際溫

度，并由使用人和保管人簽字。

(6)每批培養(yǎng)物培養(yǎng)后，要定期對培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行消毒，以免交叉污

染。

3.恒溫振蕩培養(yǎng)箱需恒溫振蕩培養(yǎng)的微生物可用此培養(yǎng)箱

培養(yǎng)。其內(nèi)部有冷、熱氣流風(fēng)道使箱內(nèi)氣體循環(huán)流暢，溫度比較均勻。

實驗室應(yīng)根據(jù)需要選擇相應(yīng)溫度范圍和振蕩頻率的培養(yǎng)箱使用。

16

使用時注意事項：

(1)設(shè)備要求工作地面平整且后部有散熱空間，切勿沖擊散熱片。

(2)設(shè)備移動時要平行移動，任一方向不可傾斜大于45度。

(3)搖盤上的螺釘要經(jīng)常檢查，以免所夾物品脫落。

(4)如長期工作在“制冷”狀態(tài)時或停機(jī)三個月以上，要按期做加

熱驅(qū)潮處理，每隔兩周一次。

(5)使用中定時觀測箱內(nèi)溫度和轉(zhuǎn)速，并做記錄。

(6)如發(fā)生故障，應(yīng)由專業(yè)人員檢修。

4.厭氧(C02)培養(yǎng)箱主要用于厭氧菌、微需氧菌等的培

養(yǎng)。一般由控溫、抽空、細(xì)菌過濾、細(xì)菌培養(yǎng)罐以及箱外的各種壓縮

氣體鋼瓶組成。使用時注意事項：

(1)N2、C02鋼瓶可立于箱體旁與箱體相連，H2鋼瓶應(yīng)另置安全

處，以免發(fā)生危險，用時用橡皮袋取出少許，與上述鋼瓶配用。

(2)作厭氧培養(yǎng)時，打開培養(yǎng)罐門，將已接種好的培養(yǎng)物放人罐

內(nèi)并迅速放人催化劑鋁粒、干燥劑、亞甲基藍(lán)指示劑，關(guān)閉罐門并扭

緊。

(3)打開此罐的電磁閥開關(guān)和真空泵開關(guān)，抽氣至真空度達(dá)到

93.3kPa時,關(guān)閉真空泵開關(guān)。

(4)開啟N2輸氣閥，慢慢開啟N2鋼瓶和減壓閥，使罐內(nèi)充滿N2

氣，關(guān)閉N2氣，開啟真空泵抽氣，然后再用N2充氣一次。

(5)第三次按N280%、H210%、C0210%充氣。待指針回至零

位時關(guān)閉輸氣閥，再關(guān)減壓閥和電磁閥。不可出現(xiàn)負(fù)壓，影響厭氧環(huán)

17

境。

(6)選擇所需溫度，進(jìn)行培養(yǎng)。

(7)在培養(yǎng)過程中不可打開培養(yǎng)罐門。以免破壞厭氧環(huán)境。

(8)使用過程中要經(jīng)常觀測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，并進(jìn)行記錄。

常用儀器知識點一一顯微成像類

1.顯微鏡可分為普通光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，實驗室可根據(jù)觀

測項目不同選擇相應(yīng)的類型。利用光的衍射作用，以可見光為照明光

源的普通光學(xué)顯微鏡的分辨極限為200nm,可觀測細(xì)菌和細(xì)胞，但對

于細(xì)菌和細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)以及病毒，光鏡無法辨認(rèn)；電鏡以電子束為照

明光源，其波長極短，可有效提高其分辨率，達(dá)到0.2nm,用電磁透

鏡代替玻璃透鏡。

2.暗視野顯微鏡可分辨0.04微米的物體，微生物實驗室多

用于觀察未染色標(biāo)本活的細(xì)菌、真菌等，并可觀察活細(xì)胞內(nèi)的線粒體

及細(xì)菌鞭毛的運動。但其只能看到物體的存在和運動，不能看清其細(xì)

胞結(jié)構(gòu)。載玻片厚度為1.0mm,且載玻片和蓋玻片需清潔無劃痕；

標(biāo)本濃度不宜過濃。

3.熒光顯微鏡熒光顯微鏡是利用熒光光源(紫外光)作為

激發(fā)光，透過經(jīng)熒光色素染色的標(biāo)本，輻射出比激發(fā)光的波長較長的

熒光，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)放大后，可觀察其可見的熒光圖像，可分辨標(biāo)本內(nèi)

一些物質(zhì)的性質(zhì)與位置。

18

常用儀器知識點一一滅菌、消毒類

濾菌器是利用微孔濾膜的微小孔徑通過抽濾或壓濾，將微生物阻

留在濾膜上，以便進(jìn)一步培養(yǎng)分析。從材質(zhì)的不同可分為玻璃濾菌器

和金屬濾菌器等；從工作原理的不同可分為負(fù)壓抽濾和正壓壓濾。

1.超凈工作臺超凈工作臺是微生物實驗室通常使用的無菌

操作臺，比一般的無菌操作室更潔凈.其潔凈度可達(dá)百級。超

凈工作臺采用層流技術(shù)凈化空氣，分為水平式和垂直式，在層流

有效區(qū)內(nèi)保持無菌環(huán)境。但不能保證微生物不污染環(huán)境和操作人

員。而另加一套空氣回收系統(tǒng)的生物安全凈化工作臺，可避免被

檢材料污染環(huán)境和操作人員。

2.生物安全柜生物安全柜可提供樣品和工作人員的雙重保

護(hù)。過濾后的潔凈氣流從安全柜頂部吹下，通過工作區(qū)域，在到

工作人員的呼吸區(qū)域前被俘獲。氣流在放空前將被過濾,一般情況

下過濾后的空氣將被排回實驗室。超凈工作臺提供的是對樣品的

保護(hù)，對操作者和環(huán)境是不提供保護(hù)的；而生物安全柜同時提供

對操作者、環(huán)境和樣品的保護(hù)。生物安全柜可分為一級、二

級和三級三大類以滿足不同的生物研究和防疫要求。

(1)一級生物安全柜可保護(hù)工作人員和環(huán)境而不保護(hù)樣品。氣流

原理和實驗室通風(fēng)櫥一樣，不同之處在于排氣口安裝有HEPA過濾

器。所有類型的生物安全柜都在排氣和進(jìn)氣口使用HEPA過濾器。

一級生物安全柜本身無風(fēng)機(jī)，依賴外接通風(fēng)管中的風(fēng)機(jī)帶動氣流,

19

由于不能保護(hù)柜內(nèi)樣品，目前已較少使用。

(2)二級生物安全柜是目前應(yīng)用最為廣泛的柜型。按照NSF49的

中的規(guī)定，二級生物安全柜依照人口氣流風(fēng)速、排氣方式和循環(huán)

方式可分為4個級別：Al,A2,Bl,B2O所有的二級生物安全柜

都可提供工作人員、環(huán)境和樣品的保護(hù)。

(3)三級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設(shè)計的，柜

體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進(jìn)行操作，俗稱手

套箱，試驗品通過雙門的傳遞箱進(jìn)出安全柜以確保不受污染，適

用于高風(fēng)險的生物試驗。生物安全柜柜內(nèi)操作主要注意事項：

A.緩慢移動原則：為了避免影響正常的風(fēng)路狀態(tài)，柜內(nèi)操作時手

應(yīng)該盡量平緩移動。

B.物品平行擺放原則：為了避免物品和物品之間的交叉污染現(xiàn)象

產(chǎn)生，在柜內(nèi)擺放的物品應(yīng)該盡量呈橫向一字?jǐn)[開，避免回風(fēng)過

程中造成交叉污染。同時避免堵塞背部回風(fēng)隔柵影響正常風(fēng)路。

C.避免震動原則：柜內(nèi)盡量避免震動儀器(例如離心機(jī)漩渦振蕩

器等)的使用，因為震動會使得積留在濾膜上的顆粒物質(zhì)抖落。

導(dǎo)致操作室內(nèi)部潔凈度降低，同時如果在前操作面平衡失敗還會

引起安全柜對操作者的污染。

D.不同樣品柜內(nèi)移動原則：柜內(nèi)兩種及以上物品需要移動時，一

定遵循低污染性物品向高污染性物品移動原則，避免污染性高的物品

在移動過程中產(chǎn)生對柜體內(nèi)部的大面積污染。

E.明火使用原則：柜內(nèi)盡量不要使用明火！因為在明火使用過程

20

中產(chǎn)生的細(xì)小顆粒雜質(zhì)將被帶入濾膜區(qū)域，這些高溫雜質(zhì)會損傷濾膜。

無法避免一定需要使用的時候，宜使用低火苗的本生燈。

F、需定時檢測工作臺性能，并記錄檢測結(jié)果，根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)

整過濾器。

G、該設(shè)備應(yīng)有專人保管并記錄使用和檢修情況。

消毒知識點一一干熱滅菌法干熱的殺菌作用是通過脫水干

燥和大分子變性。一般細(xì)菌繁殖體，在干燥狀態(tài)下80?100℃經(jīng)1小

時可被殺死；芽胞則需160?170C,2小時才能殺滅。干熱滅菌機(jī)制

如下：①使菌體蛋白質(zhì)變性；②電解質(zhì)濃縮引起中毒。

干熱滅菌法包括：

(1)焚燒法：用火焚燒，是一種徹底的滅菌方法，僅適用于廢

棄的污染物品和有傳染性的動物尸體等。

(2)燒灼法：微生物操作用器材可在火焰上燒灼滅菌，但在分

子生物學(xué)實驗中已不主張使用。

(3)干烤法：需在干烤箱內(nèi)進(jìn)行，通電后利用高熱空氣進(jìn)行滅

菌。一般加熱160?170℃,維持2小時即可殺滅包括芽抱在內(nèi)的一

切微生物。本法滅菌物品主要限于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器

等。

(4)紅外線：產(chǎn)生熱效應(yīng)，但只能照到物體的表面，多用于醫(yī)

療器械的滅菌。

21

消毒知識點一一濕熱滅菌法濕熱滅菌法是最常用的滅菌法，效

果較好。在同一溫度下濕熱殺菌效果優(yōu)于干熱，其原因有三：①濕

熱中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固。試驗表明，蛋白質(zhì)含水量增

加，凝固所需的溫度降低；②濕熱比干熱的穿透力好，這主要是由于

水或蒸汽傳導(dǎo)熱能的效率明顯高于空氣；③蒸汽有潛熱存在。每一克

水在100C時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出529卡的熱量。這種潛熱能迅

速提高被滅菌物質(zhì)的溫度。濕熱殺菌機(jī)制相對復(fù)雜，主要有以下

幾點：①使菌體蛋白質(zhì)變性和凝固；②使細(xì)菌核酸降解；③使細(xì)菌胞

漿膜損傷。

常用的濕熱殺菌法有：

(1)煮沸法：煮沸100C5分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，但一般消毒

以煮沸10分鐘為宜，殺死芽胞則需煮沸1~3小時。煮沸法主要用于

一般外科器械、注射器、膠管和食具等的消毒。若水中加入1%?2%

碳酸氫鈉，可提高沸點105C,既可增強(qiáng)殺菌能力，又可防止金屬器

械生銹。

(2)流動蒸汽滅菌法：又稱常壓蒸汽消毒法，是利用一個大氣壓

下100C的水蒸汽進(jìn)行消毒，加熱15?30分鐘可殺死細(xì)菌的繁殖體，

但不保證殺死芽抱。

(3)間歇蒸汽滅菌法：是利用反復(fù)多次的流通蒸汽殺死細(xì)菌所有

繁殖體和芽胞的一種滅菌法。本法適用于耐熱物品，也適用于不耐熱

的含糖、牛奶等培養(yǎng)基。

(4)高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌法，

22

滅菌的溫度取決于蒸汽的壓力。在一個大氣壓下,蒸汽的溫度是100℃。

如果蒸汽被限制在密閉的容器里，隨著壓力的升高，蒸汽的溫度也相

應(yīng)的升高。在103.4kPa(l.05kg/cm2)蒸汽壓力下，溫度達(dá)到121.3℃,

維持15?20分鐘，可殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有的微生物。此法

適用于高溫和不怕潮濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)

器械、注射器、手術(shù)衣、敷料和橡皮手套等耐高溫、耐濕熱物品的消

毒。

(5)巴氏消毒法：常用于牛奶和酒類的消毒。此法可殺死物品中

的病原菌或一般雜菌，而不嚴(yán)重破壞物品的質(zhì)量。方法有兩種：一種

是加熱61.1?62.8℃30分鐘；另一種是71.7℃經(jīng)15?30秒，現(xiàn)廣

泛采用后法。

消毒知識點一一其他物理殺菌方法

(一)輻射殺菌法1.紫外線日曬是一種有效的天然殺菌方法,

其殺菌作用主要是靠日光中的紫外線。將病人的被褥、衣服、書報等

放在日光下暴曬數(shù)小時，可達(dá)到消毒之目的。一般用于消毒的人工紫

外線是由低壓水銀蒸汽燈、紫外線燈產(chǎn)生的。由于紫外線穿透力較弱，

不能透過玻璃、紙張等物品，故只適用于空氣和物品表面的消毒。紫

外線對人體皮膚和眼睛角膜有一定的損傷作用，使用紫外線燈照射時

應(yīng)注意防護(hù)。紫外線的殺菌作用與其波長有關(guān)，通常波長為240?

280nm者具有殺菌作用。其中以260nm最強(qiáng)。2.電離射線電

離射線具有較高的能量和穿透力，可直接或間接破壞微生物的核酸、

23

蛋白質(zhì)和酶系統(tǒng)，從而對其產(chǎn)生致死效應(yīng)。用于消毒滅菌的電離射線

有X射線

（二）濾過除菌法濾過除菌是用特殊的器具將液體或空氣中細(xì)

菌除去的方法。所用器具是含有微細(xì)小孔的濾菌器，通常大于孔徑的

細(xì)菌不能通過，借以獲得無菌液體或空氣。主要用于不耐高溫滅菌的

血清、毒素、抗生素、藥液和空氣等的除菌，除菌濾器一般不能除去

病毒、支原體和L型細(xì)菌。濾菌器的種類很多，目前常用的有蔡

氏濾菌器、玻璃濾菌器、薄膜濾菌器。

（三）超聲波殺菌法超聲波可以裂解多數(shù)的細(xì)菌，尤其是革蘭陰

性菌更為敏感，但往往有殘存者。目前，超聲波主要用于粉碎細(xì)胞,

以提取細(xì)胞組份或制備抗原等。超聲波裂解細(xì)菌的機(jī)制主要是它通過

水時發(fā)生的空（腔）化作用，在液體中造成壓力改變。

（四）干燥與低溫抑菌法有些細(xì)菌的繁殖體在空氣中干燥時會

很快死亡，例如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍亂弧菌等，但有些細(xì)

菌的抗干燥力較強(qiáng)，如溶血性鏈球菌在塵埃中存活可達(dá)25天，結(jié)核

分枝桿菌在干燥的痰中可數(shù)月不死。芽胞的抵抗力更強(qiáng)，炭疽芽胞桿

菌的芽胞耐干燥可達(dá)20多年。干燥法常用于保存食物，濃鹽或糖漬

食品可使細(xì)菌體內(nèi)水分散失，造成生理性的干燥，細(xì)菌的生命活動停

止，防止食物變質(zhì)。

低溫可使細(xì)菌的新陳代謝減慢，常用做保存細(xì)菌菌種，當(dāng)溫度回

升至適宜范圍的時候，又能恢復(fù)生長繁殖。為避免解凍時對細(xì)菌的損

傷，可在低溫狀態(tài)下真空抽去水分，此法稱為冷凍真空干燥法。

24

消毒知識點一一化學(xué)消毒法化學(xué)消毒法是利用化學(xué)藥物殺死

或抑制病原微生物的方法。具有殺菌作用的化學(xué)藥品稱化學(xué)消毒劑;

用于抑制微生物生長繁殖的化學(xué)藥品稱防腐劑?；瘜W(xué)消毒劑不僅對細(xì)

菌有毒害作用，對人體組織細(xì)胞也有損傷作用。因此，只能外用或用

于環(huán)境的消毒。

根據(jù)化學(xué)消毒劑的殺菌機(jī)制的不同，主要分為以下幾類：

（1）促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，例如酚類（高濃度）、醇類、重金

屬鹽類（高濃度）、酸堿類、醛類；

（2）干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝，例如某些氧化劑、重金屬鹽類（低

濃度）與細(xì)菌的-SH基結(jié)合使有關(guān)酶失去活性；

（3）損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜，例如酚類（低濃度）、表面活性劑、脂溶劑

等，能降低細(xì)菌表面張力并增加其通透性，胞外液體內(nèi)滲，致使細(xì)菌

破裂。酚類：石炭酸、來蘇、洗比泰等酚類化合物，低濃度時

破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使胞內(nèi)容物漏出；高濃度時是菌體蛋白質(zhì)凝固。

醇類：殺菌機(jī)制在于去除細(xì)菌胞膜中的脂類，并是菌體蛋白質(zhì)變性。

乙醇最常用，濃度70%?75%時殺菌力最強(qiáng)，高濃度因能使菌體表面

蛋白質(zhì)迅速凝固，殺菌力反而降低。重金屬鹽類：高濃度時與帶

陰性電荷的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合，使之發(fā)生變性或沉淀，也可以與細(xì)菌酶

蛋白的-SH基結(jié)合，使其喪失酶活性。氧化劑：常用的有過氧化

氫、過氧乙酸、高鋅酸鉀與鹵素等。殺菌機(jī)制依靠其氧化能力。過氧

乙酸為強(qiáng)氧化劑，對細(xì)菌的繁殖體和芽胞、真菌、病毒等都具有殺滅

25

作用，應(yīng)用廣泛，但易分解并具有刺激性和腐蝕性，不適用于金屬器

具的消毒。用于消毒的鹵素有碘和氯兩類，碘多用于皮膚的消毒，氯

多用于水的消毒。氯化合物有漂白粉、次氯酸鈣、次氯酸鈉等。表

面活性劑：常用于消毒的表面活性劑有新潔爾滅。烷化劑：殺菌

機(jī)制在于對細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用，殺菌譜廣，殺菌力強(qiáng)。常

用的有甲醛、環(huán)氧乙烷和戊二醛等。缺點是有些對人體有毒性，并且

有些烷化劑可能有致癌作用。

消毒知識點一一影響消毒滅菌的效果因素

1.消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時間消毒劑在一定濃度下，對

細(xì)菌的作用時間越長，消毒效果越好。

2.微生物的種類與數(shù)量同一消毒劑對不同微生物的殺菌效果

不同，一般的消毒劑對結(jié)核分枝桿菌的作用要比其他細(xì)菌繁殖體作

用差；70%乙醇能殺死一般細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅細(xì)菌的芽胞,

必需根據(jù)消毒對象選擇合適的消毒劑。此外，微生物的數(shù)量越大,

所需要的消毒的時間就越長。

3.溫度溫度升高可以提高消毒效果。

4.酸堿度消毒劑的殺菌作用受酸堿度的影響，例如戊二醛本

省呈中性，其水溶液呈弱酸性，不具有殺滅芽胞的作用。

5.有機(jī)物環(huán)境中有機(jī)物的存在可影響消毒的效果。

26

細(xì)菌檢驗基本技術(shù)：芽胞染色、莢膜染色及鞭毛染色

1.芽胞染色用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠在加熱條件下染

色，使染料不僅進(jìn)入菌體也可以進(jìn)入芽抱內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料經(jīng)

水洗后被脫色，而進(jìn)入芽胞一經(jīng)著色則很難被水洗脫色。當(dāng)用復(fù)

染劑染色后，芽胞仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽胞囊被染成

復(fù)染劑的顏色，使芽胞和菌體更容易區(qū)分。芽胞染色的操

作步驟：制成菌懸液一孔雀綠染色1分鐘一將試管水浴加

熱15?20分鐘一用接種環(huán)取加熱染色菌液制成涂片一干燥一

固定f水洗脫色一蕃紅花或稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染1?2分鐘一水

洗一晾干一油鏡觀察。

2.莢膜染色由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通

常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色,

從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在90%

以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。在莢膜染

色方法中，以負(fù)染色法和濕墨水法較為常用，其中濕墨水法較簡

便，并且適用于各種有莢膜的細(xì)菌。

3.鞭毛染色細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為10?20nm,只

有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在

普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原

理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭

毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用鍍銀法染色。

27

在顯微鏡下，主要觀察菌落結(jié)構(gòu)，表面特征和菌落邊緣的

形態(tài)等。例如炭疽芽胞桿菌菌落邊緣呈現(xiàn)大量卷曲的纖絲狀紋理,

稱為獅鬃樣菌落；鼠疫菌落表面呈現(xiàn)粗糙的顆粒狀突起，在血瓊

脂平板上生長的菌落邊緣帶有“花邊”；支原體的菌落呈現(xiàn)“荷包

蛋”狀等。

生活飲用水水質(zhì)微生物檢測樣品采集及處理知識點一一水樣

的采集與保存

一、水樣的采集

1.對容器的要求容器及瓶塞、瓶蓋應(yīng)能經(jīng)受滅菌的溫度，并

且在這個溫度下不釋放或產(chǎn)生任何能抑制生物活動或?qū)е滤劳龌?/p>

促進(jìn)生長的化學(xué)物質(zhì)。玻璃或聚丙烯塑料容器用自來水和洗滌劑

洗滌，然后用自來水徹底沖洗。用硝酸溶液(1+1)浸泡，再用自

來水，蒸儲水洗凈。為了除去余氯，在滅菌前向容器里加

入硫代硫酸鈉以還原余氯［每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉

(100g/L)］。

2.容器滅菌熱力滅菌是最可靠而普遍應(yīng)用的方法。熱力滅菌

分干熱和高壓蒸汽滅菌兩類。聚丙烯瓶只能用高壓蒸汽滅菌，玻

璃瓶可用兩種方法滅菌。干熱滅菌之后，玻璃容器是干燥的，便

于保存和應(yīng)用；高壓蒸汽滅菌之后，應(yīng)自滅菌器中取出放在烤箱

內(nèi)烤干，干熱滅菌所需溫度較高、時間較長。高壓蒸汽滅菌法要

28

求121C15分鐘，即可殺死芽胞。干熱滅菌法殺死芽胞需160℃?

180℃＞維持2小時。

3.為了除去余氯，在滅菌前向容器里加入硫代硫酸鈉以還原

余氯［每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉(100g/L)］。

4.采集自來水時應(yīng)開啟水龍頭，適當(dāng)放水?dāng)?shù)分鐘后再取樣。

二、水樣的保存方法

4℃保存，4小時內(nèi)進(jìn)行檢驗。

醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識點一一醫(yī)療機(jī)構(gòu)污泥的

采樣和樣品處理

所采集的樣品應(yīng)具有代表性，制成約500g的表層和中層的平均

混合樣品，置于無菌容器中帶回實驗室。

污水樣品采集后應(yīng)按檢驗要求盡快檢驗，如不能及時檢驗，應(yīng)將

樣品放置冰箱內(nèi)保存，并應(yīng)在6小時內(nèi)檢驗。

(-)檢測糞大腸菌值時樣品的采集及處理

稱取采集的污泥樣品100g,溶解于100ml無菌生理鹽水中，充

分?jǐn)嚢杈鶆?，用無菌吸管吸取此混懸液2ml,加入發(fā)酵管中培養(yǎng)；并

將此混懸液依次稀釋后，吸取不同濃度的稀釋液按檢驗要求接種發(fā)酵

管培養(yǎng)。

(二)檢測沙門菌和志賀菌時樣品的采集和處理

稱取采集的污泥樣品30g,放入滅菌容器內(nèi)，加入300ml無菌生

理鹽水，充分?jǐn)嚢杌靹?，制?：10混懸液，用無菌吸管吸取此混懸

29

液100ml加入相應(yīng)增菌液中培養(yǎng)。

（三）檢測結(jié)核桿菌時樣品的采集和處理

稱取采集的污泥樣品10g,放入滅菌容器內(nèi)，加入100ml無菌水

沖洗過濾（濾紙漏斗），再經(jīng)玻璃漏斗G2（孔徑10?15P.m）和G4

（孔徑3?4p.m）抽濾，最后再經(jīng)濾膜（孔徑0.45-0.7觸）抽濾。

取下濾膜，用4%硫酸3ml,充分振蕩沖洗30分鐘。取上述酸性溶液

各0.1ml,分別接種培養(yǎng)。

（四）檢測蛔蟲卵時樣品的采集和處理

采集回的樣品應(yīng)立即檢驗,如不能立即檢驗應(yīng)加入5~10ml3%

或5%甲醛或3%鹽酸溶液，用平皿蓋住廣口瓶瓶口，然后放于冰箱

內(nèi)，以防止微生物繁殖和蛔蟲卵的發(fā)育。

醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識點一一醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水的

采樣和樣品處理

所采集的樣品應(yīng)具有代表性，采集后應(yīng)立即登記，編寫檢驗序號,

并按檢驗要求盡快檢驗，如不能及時檢驗，應(yīng)將樣品放置冰箱內(nèi)保存,

并應(yīng)在6小時內(nèi)檢驗。

（-）檢測總余氯指標(biāo)時樣品的采集及處理

1.所檢測樣品需在醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水最終排放口處用沖洗干凈的玻

璃容器采集。

2.采樣后應(yīng)立即檢測，避免強(qiáng)光、振蕩及溫?zé)岬纫蛩氐挠?/p>

響。

30

為避免污水中懸浮性固體對檢測結(jié)果的影響，可用離心機(jī)離心分

離，棄去懸浮物沉淀。

3.被測樣品的溫度應(yīng)在15℃?20℃。如低于此溫度，應(yīng)先將盛

樣品的玻璃容器放入溫水中，使其溫度升至要求溫度后，再測定數(shù)

值。

（二）檢測糞大腸菌群時樣品的采集及處理

1.用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml,放入滅菌瓶內(nèi)

（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5%硫代硫酸鈉溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水樣應(yīng)立即運往實驗室檢驗，一般不宜超過2小時，

否則應(yīng)在10℃下保存樣品，但需在6小時內(nèi)檢測。

（三）檢測沙門菌和志賀菌時樣品的采集和處理

1.用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml,放入滅菌瓶內(nèi)

（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5%硫代硫酸鈉溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水樣應(yīng)立即運往實驗室檢驗，一般不宜超過2小時，

否則應(yīng)在10℃下保存樣品，但需在6小時內(nèi)檢測。

3.取污水250ml,用無菌紗布或脫脂棉進(jìn)行初濾，然后用濾膜

進(jìn)行抽濾，將初濾后的紗布或脫脂棉和濾膜，放入相應(yīng)的增菌液中進(jìn)

行增菌培養(yǎng)。

（四）檢測結(jié)核桿菌時樣品的采集和處理

1.用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml。放入滅菌瓶內(nèi)

31

（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5%硫代硫酸鈉溶液5ml中和余

氯）。

2.采集好的水樣應(yīng)立即運往實驗室檢驗，一般不宜超過2小時，

否則應(yīng)在10℃下保存樣品，但需在6小時內(nèi)檢測。

3.根據(jù)檢驗條件，可選用濾膜集菌法和離心集菌法進(jìn)行集菌，

然后進(jìn)行接種和培養(yǎng)。

（1）濾膜集菌法：采用經(jīng)煮沸消毒的醋酸纖維膜（孔徑0.3?

0.7觸）和特制的金屬濾器，抽濾500ml污水，根據(jù)懸浮物的多少，

一份水樣要更換數(shù)張濾膜，將同一份水樣的濾膜集中于小燒杯中，用

4%硫酸溶液反復(fù)沖洗，靜置30分鐘，收集洗液于離心管中，3000

轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，棄去上清液。沉淀物中加1ml滅菌生理鹽水

混合均勻后，供接種用。

（2）離心集菌法：將水樣500raL分裝于50ml或200ml滅菌離心

管中，3000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，同一份水樣的沉淀物集中于試管

中，加等量4%硫酸處理30分鐘，供接種用。如體積過大，再次離

心濃縮后接種?；瘖y品微生物檢測樣品采集及處理知識點一一樣品

的采集及注意事項1.所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視

每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗時，應(yīng)分

別從2個包裝單位以上的樣品中共取10g或10ml。包裝量小于20g

的樣品，采樣量可以適當(dāng)增加，其總量應(yīng)大于16go2.供檢

驗樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。進(jìn)口產(chǎn)品應(yīng)為市售包裝。容器

不應(yīng)有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。3.接到

32

樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不

能及時檢驗，樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。

4.若只有1個樣品而同時需作多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，

應(yīng)先作微生物檢驗，再將剩余樣品作其他分析。5.在檢驗過

程中，從打開包裝到全部檢驗操作結(jié)束，均需防止微生物的再污染和

擴(kuò)散，所用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌

室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。

化妝品微生物檢測樣品采集及處理知識點一一供檢樣品的制備

（-）液體樣品1.水溶性的液體樣品，可量取10ml加到90ml

滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5ml

則加到45m滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1：10檢液。2.油

性液體樣品，取樣品10ml,先加5ml滅菌液狀石蠟混勻，再加10ml

滅菌的吐溫-80,在40?44℃水浴中振蕩混合10分鐘，加入滅菌的

生理鹽水75ml（在40℃?44c水浴中預(yù)溫），在40℃?44c水浴中

乳化，制成1：10的懸液。

（二）膏、霜、乳劑半固體狀樣品1.親水性的樣品。稱取10g,

加到裝有玻璃珠及90ml滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻。

靜置15分鐘。用其上清液作為1：10檢液。2.疏水性樣品,

稱取10g,放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液狀石蠟，研磨成黏稠

狀，再加入10ml滅菌吐溫80,研磨待溶解后。加70ml滅菌生理鹽

水，在40℃?44c水浴中充分混合，制成1：10檢液。

33

（三）固體樣品稱取10g,加到90ml滅菌生理鹽水中，充分

振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1：10檢液。

如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等.可稱10g樣品加入

90ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)1?2分鐘；疏水性膏、霜及眉筆、唇膏等，

稱10g樣品，加10ml滅菌液狀石蠟，10ml滅菌吐溫-80,70ml滅菌

生理鹽水，均質(zhì)3?5分鐘。

公共場所樣品采集方法及處理知識點一一空氣微生物樣品采集及處

理

（一）撞擊法

1.選擇有代表性的位置設(shè)置采樣點。將采樣器消毒，按儀器使

用說明進(jìn)行采樣。

2.樣品采完后，將帶菌營養(yǎng)瓊脂平板置36℃±1℃恒溫箱中，

培養(yǎng)48小時，計數(shù)菌落數(shù)，并根據(jù)采樣器的流量和采樣時間，換算

成每立方米空氣中的菌落數(shù)。以cfu/m3報告結(jié)果。

3.選擇撞擊式空氣微生物采樣器的基本要求

（1）對空氣中細(xì)菌捕獲率達(dá)95%。

（2）操作簡單，攜帶方便，性能穩(wěn)定，便于消毒。

（二）自然沉降法

1.設(shè)置采樣點時，應(yīng)根據(jù)現(xiàn)場的大小，選擇有代表性的位置作

為空氣細(xì)菌檢測的采樣點。通常設(shè)置5個采樣點，即室內(nèi)墻角對角線

34

交點為1個采樣點，該交點與四墻角連線的中點為另外4個采樣點。

采樣高度為1.2?1.5m。采樣點應(yīng)遠(yuǎn)離墻壁1m以上，并避開空調(diào)、

門窗等空氣流通處。

2.將營養(yǎng)瓊脂平板置于采樣點處，打開平皿蓋，暴露5分鐘，

蓋上平皿蓋，翻轉(zhuǎn)平板，置36℃±1℃恒溫箱中，培養(yǎng)48小時。

3.計數(shù)每塊平板上生長的菌落數(shù)，求出全部采樣點的平均菌落

數(shù)。以cfu/皿報告結(jié)果。

（一）細(xì)菌總數(shù)測定

1.隨機(jī)抽取清洗消毒后準(zhǔn)備使用的茶具。

2.用滅菌生理鹽水濕潤棉拭子，在茶具內(nèi)、外緣，涂抹50cm2,

即1?1.5cm高處一圈（口唇接觸處）。用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸的

部位，將棉拭子放人10ml生理鹽水內(nèi)，4小時內(nèi)送檢。

3.將放有棉拭子的試管充分振搖。