生物制藥第二章生物制藥技術通論模塊01生物藥物的制備技術

第二章生物制藥技術通論第一節(jié)

生物藥物的制備技術第二節(jié)

發(fā)酵工程制藥技術第三節(jié)

細胞工程制藥技術第四節(jié)

酶工程制藥技術第五節(jié)

基因工程制藥技術第一節(jié)

生物藥物的制備技術一、材料選擇二、材料的預處理三、提取技術四、固液分離技術五、純化、結晶六、濃縮、干燥一般工藝程序生物材料胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞碎片提取液濃縮液初步分離產(chǎn)物高度純化產(chǎn)物產(chǎn)品（原料藥）細胞破碎濃縮提取技術沉淀、膜分離層析、電泳、結晶濃縮、干燥一般工藝程序RETURN固液分離技術固液分離技術選擇原則：

1、來源豐富、成本低、目的物含量高、易于分離純化的材料

材料來源豐富，而含量不高；或材料來源豐富、含量高，但材料的雜質(zhì)含量太多，分離純化手續(xù)繁瑣，以致影響質(zhì)量和收率，反而不如采用低含量易于操作的原料；

2、種屬特異性、發(fā)育階段、生理狀態(tài)、解剖部位等因素的影響

種屬特異性影響到原料中待提取蛋白質(zhì)的含量、結構、生物學活性及其抗原性。例如：來源于豬垂體的生長素對人體無效，不能用于人體。被提取蛋白質(zhì)的原料中的含量還受到原料解剖部位的影響。例如：豬胰臟尾部含激素較多，豬胰臟頭部含消化酶較多，單獨收集胰頭提取消化酶，收集胰尾提取激素，有利于提高產(chǎn)率。一、材料的選擇P17RETURN二、生物材料的預處理——

組織與細胞的破碎方法1、機械法

常用器械：機械搗碎機、勻漿器、研缽等。機械搗碎機適用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉和芽等材料破碎，但不適用于大分子的提取產(chǎn)物。勻漿器破碎細胞的程度比機械搗碎機高，主要用于少量樣品的制備。研缽多用于細菌或其他堅硬植物材料，研磨時加入少量石英砂、玻璃粉等研磨劑，有利于提高研磨效率。2、物理法常用方法：反復凍融法、急熱驟冷法、超聲波處理、加壓破碎法。反復凍融法是先將樣品深冷至－20～－15℃使之凝固，再緩慢地融化，反復多次可使大部分細胞及細胞內(nèi)顆粒破壞，常用于處理動物性材料，但脂蛋白會變性失活。急熱驟冷法是將樣品投入沸水中，于90℃左右加熱數(shù)分鐘，立即置冰水浴中使其迅速冷卻，則絕大多數(shù)細胞被破壞。超聲波處理是利用超聲波產(chǎn)生的機械振動使細胞破碎，適用于微生物材料。其缺點是可導致對超聲波敏感蛋白失活，另外超聲波產(chǎn)生的熱量亦可能使熱敏蛋白質(zhì)失活。加壓破碎法是利用氣壓或水壓破碎細胞，每小時可以處理數(shù)十乃至數(shù)千升的樣品，適用于微生物發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)。二、生物材料的預處理——

組織與細胞的破碎方法3、化學法和酶法

方法：有機溶劑法、自溶法、酶解法、表面活性劑處理法。有機溶劑法是于0℃以下在粉碎后的新鮮材料中加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌，可破碎細胞，亦使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)分開，有利于進一步的純化。表面活性劑處理法是利用細胞膜對表面活性劑不穩(wěn)定的原理來破碎細胞。如：十二烷基硫酸鈉（SDS）、氯化十二烷吡啶、去氧膽酸鈉。自溶法是利用細胞自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內(nèi)含物釋放出來。自溶法所需的時間長，不易控制，難以在工業(yè)上使用。酶解法適用于細菌、植物等含細胞壁的材料，如：利用溶菌酶、纖維素酶、半纖維素酶、蝸牛酶、酯酶等專一性的酶水解細胞壁，得到細胞的內(nèi)含物。二、生物材料的預處理——

組織與細胞的破碎方法RETURN（一）提取類型與影響因素三、提取技術1、提取類型（1）固液提?。ㄓ址Q浸取、浸提、抽提）：目標物在細胞中呈固相或與固體結合存在，提取時由固相轉入液相，稱為固—液萃取，常用萃取劑為水。（2）液液提?。ㄓ址Q萃?。耗繕宋镆殉室合啻嬖冢腿r由液相轉入另一液相，稱為液—液萃取，因常用有機溶劑作為萃取劑，所以也叫溶劑萃取。三、提取技術2、影響因素（1）溶解度的大?。哼x擇合適溶劑，一般遵守“相似相溶”的原則。（2）擴散速度：增加溫度、降低溶液的黏度、增加擴散面積、減少擴散距離、攪拌和延長時間等。提取原則：“少量多次”，對于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取的效果好。（二）提取方法三、提取技術1、水溶液提取2、表面活性劑提取3、有機溶劑萃取1、水溶液提取三、提取技術水溶液（一般為緩沖液）是生物藥物提取中最常用的溶劑，可以利用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液進行提取。“鹽溶”作用：鹽離子的存在能減弱生物分子間離子鍵及氫鍵的作用力，稀鹽溶液可促進蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解?！胞}解”作用：某些與細胞結構結合牢固的生物活性物質(zhì)，在提取時采用高濃度鹽溶液（如4mol/L鹽酸胍，8mol/L脲或其他變性劑）。2、表面活性劑提取三、提取技術一些采用水鹽系統(tǒng)難于提取的蛋白質(zhì)、酶、核酸，可采用表面活性劑提取。離子表面活性劑（如膽酸鹽、十二烷基磺酸鈉）如：十二烷基磺酸鈉（SDS），利于破壞核酸與蛋白質(zhì)的離子鍵合，對核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。非離子表面活性劑（如吐溫60、吐溫80等）。3、有機溶劑萃取三、提取技術對于水不溶性的脂類、脂蛋白、膜蛋白結合酶等，可采用有機溶劑進行提取。常見的有機提取溶劑有乙醇、丙酮、丁醇。單一溶劑分離法多種溶劑組合分離法如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取，可以從動物腦中依次分離出膽固醇、卵磷脂和腦磷脂。3、有機溶劑萃取三、提取技術常用丙酮處理某些生化原材料，制成“丙酮粉”。作用：使材料脫水、脫脂；細胞結構松散，增加穩(wěn)定性，有利于活性成分的提??；同時又減少了體積，便于貯存和運輸。應用丙酮粉提取，可以減少提取液的乳化程度及黏度，有利于離心與過濾操作。4、雙水相萃取技術三、提取技術兩種親水性聚合物混合溶于水中，低濃度時可以得到均勻單項液體體系；隨著各自濃度的增加，溶液會變得渾濁；當各自達到一定濃度時，就會產(chǎn)生互不相溶的兩相。兩相都以水分為主，所以形成高聚物-高聚物雙水相體系。類型：（1）高聚物/高聚物雙水相體系（2）高聚物/無機鹽雙水相體系（3）低分子有機物/無機鹽雙水相體系（4）表面活性劑雙水相體系雙水相的形成

如葡聚糖與聚乙二醇按一定比例與水混合，靜置平衡后，分成互不相溶的兩個水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖

5、超臨界流體萃取技術三、提取技術在超臨界區(qū)，無論壓力有多高，分子之間的距離會縮小，密度會增大，但分子之間都有一定的距離，依舊不會變成液體。這種既不是氣體也不是液體的物質(zhì)狀態(tài)，稱為“流體”，即超臨界流體。常見的超臨界流體還有二氧化碳、乙烷、丙烷等。超臨界狀態(tài)下的流體對溶質(zhì)的溶解度大大增加，是良好的分離介質(zhì)，根據(jù)這些特性發(fā)展起來的萃取技術稱為超臨界流體萃取技術。80年代超臨界二氧化碳萃取技術泛用于香料的提取。90年代后，超臨界二氧化碳萃取技術用于從藥用植物中提取藥用有效成分等。CO2超臨界萃取裝置四、固液分離技術固液分離技術膜分離技術過濾分離技術離心分離技術傳統(tǒng)過濾技術離心過濾技術離心沉降技術（一）過濾分離技術1、定義：以多孔性物質(zhì)為過濾介質(zhì)，在外力（重力、壓力或離心力）作用下，流體（液體或氣體）及小顆粒固體通過介質(zhì)孔道，而大的固體顆粒被截留，從而實現(xiàn)流體與固體顆粒分離的技術。2、分類：（1）重力過濾（2）加壓過濾（3）真空過濾（4）離心過濾（5）膜過濾利用懸浮液自身的重力為過濾動力，速度慢，效率低利用氣壓或泵為過濾動力，推動液體前進，常用的方法反向端抽真空，形成負壓，抽出液體，設備成本高利用離心力作為料液推動力，速度快，成本高利用選擇性半透膜作為分離介質(zhì)層，允許混合物中的某些組分透過而截留其他組分的一種分離技術。重力過濾加壓過濾真空過濾離心過濾（一）過濾分離技術3、過濾介質(zhì)和助濾劑（1）過濾介質(zhì)：濾布或膜（2）助濾劑：要求為惰性物質(zhì)、無毒、有一定細毒及硬度，成本低廉。常用有：硅藻土、紙漿、石棉、纖維素等過濾介質(zhì)介質(zhì)種類材料應用無定形顆粒煤渣、沙粒、活性炭澄清過濾成形顆粒燒結金屬、玻璃、塑料澄清過濾非金屬織布類棉布、化學纖維普通過濾金屬織布類不銹鋼絲網(wǎng)普通過濾無紡品濾紙、無紡濾布、濾膜精密過濾RETURN（二）離心分離技術1、定義離心分離技術是利用旋轉產(chǎn)生的離心力的作用，促使不同大小、不同密度的顆粒分離的技術。2、分類按分離原理分2種：離心沉降、離心過濾按工作目的分2種：制備、分析按離心速度分3種：低速、高速、超速離心機低速離心機高速冷凍離心機不同轉速離心機比較類型低速離心機高速離心機超速離心機轉速rpm<800010000~2500025000~150000RCF（×g）<1000010000~100000100000~1000000分離形式固液沉淀固液沉淀密度梯度離心應用范圍收集易沉淀大顆粒（細胞碎片、顆粒）分離硫胺沉淀物、免疫沉淀物等分離細胞器、病毒、核酸、蛋白質(zhì)分子離心轉速與離心力FC：離心力m：粒子質(zhì)量r：粒子到軸心的距離ω：角速度五、分離純化技術（一）生化制藥工藝中分離純化特點(1)生物材料組成復雜(2)目的物含量低(3)易變性、失活(4)分離方法有很大經(jīng)驗成分(5)步驟多，逐級分離(6)產(chǎn)品驗證與化學上純度概念不完全相同（二）分離純化原理

P19（1）利用溶解度不同的純化方法鹽析法、有機溶劑法、等電點沉淀法、加熱變性法。（2）利用分子結構和大小不同的純化方法凝膠色譜法、超濾法。（3）利用電離性質(zhì)不同的純化方法電泳法、等電聚焦。（4）利用生物功能專一性（親合性）親和色譜（層析）法。（5）根據(jù)吸附特性不同的純化方法吸附色譜（層析）法。（三）選擇原則（1）粗品分離大處理量，相對低分辨率鹽析，分級沉淀，萃取，超濾（2）精制高分辨率多種色譜層析法，親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦，結晶純化（purification）：是指利用目標物的特性將其從混雜的物質(zhì)中分揀出來的過程及技術。一般分為初級純化和精細純化。（四）分離純化方法1、沉淀技術2、膜分離技術3、層析技術4、電泳技術5、結晶技術初級純化技術，如鹽析沉淀、等電沉淀、有機溶劑沉淀、超濾、透析等精細純化技術，如凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、區(qū)帶電泳、等電聚焦等最后的純化技術1、沉淀技術Precipitation沉淀可分為晶形沉淀和非晶形沉淀兩大類型。生物大分子沉淀有其特殊的性質(zhì)，是利用溶解性不同實現(xiàn)分離，屬于非晶形沉淀，為分子凝集作用的結果。（1）鹽析沉淀法（2）等電沉淀法（3）有機溶劑沉淀法（4）成鹽沉淀法（5）選擇性變性沉淀法（1）鹽析沉淀法定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。優(yōu)點：簡單、經(jīng)濟、較少變性缺點：分辨率不高，要除鹽①原理兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大。鹽析：高鹽，鹽離子強度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小。鹽析沉淀法鹽析沉淀的機制：破壞生物分子（蛋白質(zhì)）表面的水化膜，使得分子凝集沉淀。②鹽的選擇鹽析能力：半徑小的高價離子在鹽析時的作用較強，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價陰離子更為明顯。

PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―

NH4+＞K+＞Na+＞Li+

常用：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等③鹽的濃度各種活性成分分子的顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不相同。常用“飽和度”來表示中性鹽的的濃度。如：25℃時(NH4)2SO4的飽和濃度為4.1mol/L，定義它為100%飽和度。操作：直接投固體粉末、加入硫酸銨飽和溶液。鹽析沉淀—硫酸銨飽和度表200ml初始液，欲使其飽和度達到30%，需加入硫酸銨多少克？在此基礎上，欲使其飽和度達到80%，需加入硫酸銨多少克？④影響鹽析的因素A．不同溶質(zhì)，B．溶質(zhì)的濃度，C．pH值，D．溫度。⑤鹽析方法1、分部鹽析法2、重復鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。分部鹽析法反抽提法(RNA聚合酶)⑥注意事項A．防止“局部過濃”B．溫度（室溫）C．沉淀需要經(jīng)一段老化時間后進行分離。（2）等電沉淀法在等電狀態(tài)時，帶電物質(zhì)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種物質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到等電點使之沉淀。在等電點時，兩性離子的凈電荷為零（即正負電荷相等），此時分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等電沉淀法1．不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點。2．同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點不同。

3．目的藥物成分對pH值的要求。

4．考慮采用幾種方法結合來實現(xiàn)沉淀分離。（3）有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇、乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應在低溫下進行。冷乙醇法是目前WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法，不僅分辨率高、提純效果好、可同時分離多種成分，而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。有機溶劑沉淀法（4）成鹽沉淀法生物大分子和小分子都可以生成鹽類復合物沉淀。與金屬生成沉淀：生物分子中的酸性基團可與多種金屬鹽發(fā)生沉淀反應，包括Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+、Zn2+、Li2+等。與有機酸生成沉淀：生物分子中的堿性基團可與有機酸發(fā)生沉淀反應，如苦味酸、鞣酸、三氯乙酸等?？辔端幔≒ICRICACID）鞣酸（CHEBULINICACID）三氯乙酸（TRICHLOROACETICACID）（5）選擇性變性沉淀法這是個特殊的方法，它的目的是利用生物分子對某些理化因素（如變性劑、熱、酸堿性）的敏感度不同，而有選擇地使之變性沉淀，去除雜質(zhì)，保留目標物。選擇性變性劑：表面活性劑、重金屬鹽、某些有機酸、酚類、鹵代烷等。選擇性熱變性選擇性酸堿變性選擇性變性沉淀法pH對不同蛋白質(zhì)溶解性的影響選擇性熱變性：黑曲霉發(fā)酵制備脂肪酶時，混雜有大量淀粉酶。40℃，pH3.4，2.5h淀粉酶90%沉淀脂肪酶不受影響二者分離，利于以后的脂肪酶純化溫度對不同酶活性的影響此類沉淀方法的缺點：選擇性不強使用時一定注意選擇的方法對目標物無害；沉淀后盡快分離，去除沉淀劑2、膜分離技術借助于膜而實現(xiàn)各種分離的過程稱為膜分離。特點：①高效：由于膜具有選擇性，它能有選擇性地透過某些物質(zhì)，而阻擋另一些物質(zhì)的透過。選擇合適的膜，可以有效地進行物質(zhì)的分離，提純和濃縮。②節(jié)能：多數(shù)膜分離過程在常溫下操作，被分離物質(zhì)不發(fā)生相變,是一種低能耗，低成本的單元操作。③過程簡單、容易操作和控制。④不污染環(huán)境。膜分離技術類型（1）透析（2）微孔濾膜過濾技術（3）超過濾（1）透析透析是采用半透膜作為濾膜，使試樣中的小分子經(jīng)擴散作用不斷透出膜外,而大分子不能透過被保留在透析袋內(nèi)，從而達到大小分子分離的一種膜過濾方法。①半透膜的材料獸類的膀胱、硝酸纖維素膜、玻璃紙。②應用除去小分子物質(zhì)及其雜質(zhì)，脫鹽。透析袋

③透析過程及注意點A.預處理：煮沸1h；B.透析前，對裝有試液的透析袋檢查是否有泄漏；C.透析袋裝一半左右，防止膜外溶劑因濃度差滲入將袋漲裂或過度膨脹使膜孔徑改變；D.攪拌；定期或連續(xù)更換外部溶劑可提高透析效果。透析袋的保存透析袋

使用方法透析（2）微孔濾膜過濾技術①微孔濾膜的種類再生纖維素纖維素酯膜:硝酸纖維素酯膜.醋酸纖維素酯膜.混合纖維素酯膜聚四氟乙烯膜聚氯乙烯膜超細玻璃纖維濾膜②應用0.01～0.05μm：噬菌體、病毒或大的膠體顆粒。0.1μm：試劑的超凈、分離沉淀和膠體懸液。0.2μm：高純水的制備、制劑除菌、細菌計數(shù)、空氣病毒定量測定等。0.45μm：水的超凈化處理、色譜分析時流動相的處理、放射免疫測定、光測介質(zhì)溶液的凈化以及鍋爐水中Fe(OH)3的分析等。③設備類型注射式過濾器玻璃濾器平板濾器筒式濾器注射式過濾器全玻璃微孔濾膜過濾器抽濾裝置平板濾器筒式濾器④操作與注意事項A.過濾系統(tǒng)的嚴密性B.濾膜的濕潤C.過濾速度D.過濾系統(tǒng)的清洗和消毒E.串濾技術（3）超濾技術超過濾：簡稱超濾，是一項分子級膜分離手段，以壓力差為推動力將不同分子量的物質(zhì)進行選擇性分離。①用途：A.大分子物質(zhì)的脫鹽和濃縮，以及大分子物質(zhì)溶劑系統(tǒng)的交換平衡B.大分子物質(zhì)的分級分離C.生化制劑或其它制劑的去熱原處理中空纖維濾芯②超濾裝置UF-15中空纖維超濾裝置

超濾裝置

工業(yè)化超濾設備

固定相：表面積很大的或多孔性固體。如凝膠、樹脂等。流動相：液體或氣體。分為液相色譜和氣相色譜。3、層析技術chromatography，也稱色譜技術、層離技術。定義：利用混合物中各個組分理化性質(zhì)的差異，使其按照不同比例分配到兩相中，而達到分離的目的。層析技術的分類吸附層析凝膠過濾層析離子交換層析親和層析液相層析氣相層析高效液相層析薄膜層析薄板層析層析方式柱層析不同支持介質(zhì)（1）吸附層析adsorptionchromatograpby利用固定相吸附劑對物質(zhì)分子吸附能力的差異實現(xiàn)對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程。優(yōu)點：A.設備簡單、操作簡便、價廉、安全。B.少用或不用有機溶劑，吸附過程中pH變化小，較少引起生物活性物質(zhì)的變性失活。缺點：A.

選擇性差，收率不高。B.一些無機吸附劑性能不穩(wěn)定。幾種常用的吸附劑無機：白陶土、氧化鋁、硅膠、硅藻土有機：活性炭、纖維素、大孔吸附樹脂等常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭>氧化鋁>硅膠>氧化鎂>碳酸鈣>磷酸鈣>石膏>纖維素>淀粉和糖。活性炭白陶土氧化鋁大孔吸附樹脂可分為非極性、中等極性、極性和強極性吸附劑四類。

美國羅姆-哈斯公司：Amberlite系列；日本三菱化成公司：Diaion系列。吸附劑及被吸附物極性對吸附的影響“類似物容易吸附類似物”的原則：極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)；極性吸附劑適宜從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)；非極性吸附劑適宜從極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)。洗脫劑的選擇極性溶質(zhì)：極性大的溶劑洗脫能力就大；非極性溶質(zhì)：極性小的溶劑洗脫能力就大。常用洗脫劑排序（極性增大）：

石油醚<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水<乙酸

氧化鋁或硅膠(極性強)為吸附劑洗脫劑從極性低的開始逐漸增加極性。次序：石油醚、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸?；钚蕴?非極性)為吸附劑洗脫劑從極性高的開始逐漸降低極性。次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿。吸附層析裝置（2）凝膠過濾層析

gelchromatography凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析，是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術。當混合物隨流動相經(jīng)過凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術。特點：該法設備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高。原理：凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結構、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，像篩子；小的分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。當含有分子大小不一的蛋白質(zhì)混合物樣品加到用此類凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時，這些物質(zhì)即隨洗脫液的流動而發(fā)生移動。大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱；而小分子物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進入顆粒內(nèi)部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的分子彼此獲得分離。凝膠過濾層析原理凝膠過濾適合于分離蛋白質(zhì)、酶、核酸、抗體等生物大分子（3）離子交換層析

ionexchangechromatography基本原理：離子交換層析：利用溶液中帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質(zhì)分離的操作方法。帶電粒子與離子交換劑間的作用力是靜電力。

電荷密度、電荷種類離子交換層析原理離子交換劑離子交換劑：由惰性的不溶性載體、功能基團和平衡離子組成。陽離子交換劑：平衡離子帶正電荷。陰離子交換劑：平衡離子帶負電荷。R-X++Y+R-Y++X+R-表示陽離子交換劑的功能基團和載體；X+

為平衡離子；Y+為交換離子。

離子交換樹脂吸附和洗脫過程（1）X+為平衡離子，YH+及Z+為待分離離子；（2）YH+和Z+取代X+而被吸附；（3）加堿后YH+失去正電荷，被洗脫；（4）提高X+的濃度取代出Z+離子交換的基質(zhì)帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂，如：二乙氨基乙基纖維素，DEAE-纖維素）；帶有負電荷的稱之陽離子交換樹脂，如：羧甲基纖維素，CM-纖維素）?；|(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物質(zhì)時，宜選用強酸強堿樹脂（氨基酸的分離）。蛋白質(zhì)、酶和其它生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性樹脂，減少生物大分子的變性，利于洗脫，提高選擇性。

樹脂的選擇離子交換樹脂的命名強酸類

1～100號；弱酸類

101～200；強堿類201～300；弱堿類301~400；中強酸類401～500交聯(lián)度：是合成載體骨架時交聯(lián)劑重量的百分數(shù)，用“×”將樹脂編號與交聯(lián)度分開。弱酸101×4其交聯(lián)度為4％。國內(nèi)常用樹脂命名：724；732；717常用樹脂724；弱酸陽離子交換樹脂732；強酸陽離子交換樹脂717；強堿陰離子交換樹脂常用的離子交換纖維素羧甲基纖維素（CM-C）：弱酸性陽離子交換纖維素，pK=3.6。二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-C）：強堿型陰離子交換纖維素，pK=9.1。

離子交換層析樹脂的樹脂的預處理A.物理處理：去雜，過篩。B.化學處理：用8～10倍的1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液交替浸泡。

氨基酸分離前樹脂的處理不同類型樹脂的處理樹脂的再生

樹脂再生：使用過的樹脂重新獲得使用性能的處理過程。

再生過程：A.去雜，大量水沖洗，除去物理吸附的雜質(zhì)。B.用酸、堿處理除去與功能基團結合的雜質(zhì)。C.轉型：離子交換纖維素的處理和再生

酸堿濃度要適當降低，處理時間也從4h縮短為0.3~1h。以交換緩沖液平衡。注意：不耐酸，用酸處理的濃度和時間須小心控制。（4）親和層析

(AffinityChromatography)利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應的分子專一性可逆結合的特性而建立的層析技術。

適用:從成份復雜且雜質(zhì)含量遠大于目標物的混合物中提純目標物?？贵w——抗原酶——底物DNA或RNA互補鏈特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質(zhì)；特異性強、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。A配基B配體原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。（2）吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì).（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。技術要點（1）找與底物專一可逆結合的配基；（2）將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；（3）配基與底物吸附；（4）洗脫目標物。

親和層析層析裝置（試驗室和工廠）4、電泳技術（1）原理各種帶電分子（如蛋白質(zhì)）在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。在確定的條件下，帶電粒子在單位電場強度作用下，單位時間內(nèi)移動的距離（即遷移率，Rm值）為常數(shù)，是該帶電粒子的物化特征性常數(shù)。電泳技術電泳基本設備電泳儀主要功能是提供穩(wěn)壓穩(wěn)流直流電源，就是一直流穩(wěn)壓穩(wěn)流器電泳槽電泳系統(tǒng)的核心部分，各種支持介質(zhì)的容器，電泳行為發(fā)生處電泳槽關鍵詞：1、電極2、膠板3、上槽4、下槽5、樣品池6、點樣7、前沿8、Rm值（2）電泳類型①移動界面電泳②區(qū)帶電泳③等電聚焦電泳④等速電泳區(qū)帶電泳在一定的支持物上，于均一的載體電解質(zhì)中，將樣品加在中部位置，在電場作用下，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶。按支持物的物理性狀不同，又可分為:A.紙電泳

B.纖維膜電泳

C.粉末電泳

D.凝膠電泳

E.絲線電泳電泳結果圖電泳圖譜：是在電泳后經(jīng)染色獲得的。染色的方法依據(jù)分離的分子性質(zhì)決定等電聚焦電泳等電聚焦電泳是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。5、結晶技術

（Cystallization）結晶：從液相或氣相生成形狀一定，分子（原子、離子）有規(guī)則排列的晶體的現(xiàn)象。（1）特點

①選擇性高

②純度高（2）結晶過程①形成過飽和溶液②晶核形成（有時需添加晶種）③晶體生長

過飽和是結晶的推動力

一次結晶得到的產(chǎn)品總會有一些雜質(zhì)，為了提高晶體的純度，必須將晶體用合適的溶劑溶解再次結晶，這個過程稱為重結晶。①冷卻法②蒸發(fā)法③鹽析結晶法④透析結晶法⑤有機溶劑結晶法⑥等電點法⑦化學反應結晶法調(diào)節(jié)溶液的pH或向溶液中加入反應劑，生成新物質(zhì)，結晶析出。（3）過飽和溶液的形成(結晶方法)溫度誘導法鹽析結晶法透析結晶法等電點法化學反應結晶法

綜合利用結晶設備濃縮結晶罐冷凍結晶系統(tǒng)串聯(lián)結晶系統(tǒng)各種結晶胱氨酸酪氨酸細胞色素P450血清白蛋白六、濃縮、干燥（一）濃縮技術

使溶液中溶劑蒸發(fā)、溶液濃度增大的過程。1、蒸發(fā)濃縮2、冷凍濃縮3、膜過濾濃縮蒸發(fā)濃縮凡是液體均可用蒸發(fā)的方法進行濃縮。傳統(tǒng)蒸發(fā)，就是加熱使液料沸騰而使汽體飛入空間?，F(xiàn)代蒸發(fā)則改用低溫、低壓蒸發(fā)的方法，以免損壞有效成分。旋轉蒸發(fā)儀（器）冷凍濃縮利用冰與水溶液之間的固液相平衡原理的一種濃縮方法。冷凍濃縮的操作包括兩個步驟