多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段市公開課一等獎省賽課微課金獎?wù)n件

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))，

是一個在體外快速擴增特定基因或DNA序列方法，故又稱為DNA體外擴增技術(shù)。課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段1/251、DNA分子組成成份和結(jié)構(gòu)DNA分子基本組成單位是

.共有

種,每個基本單位是由一分子

、一分子

、和一分子

組成。脫氧核甘酸4磷酸堿基脫氧核糖？

那么DNA分子平面結(jié)構(gòu)怎樣呢？二、基礎(chǔ)知識2/25脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA基本單位－脫氧核苷酸12345O3/25OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖4/25一個核苷酸上磷酸基團上“－OH”和另一個核苷酸分子第三位碳原子上羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰兩個脫氧核苷酸3’和5’碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大四種脫氧核苷酸經(jīng)過3’、5’、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團末端稱為5’端4、多脫氧核苷酸鏈得形成5/252、DNA分子平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端

識別：

DNA分子3′

端與5′

端-OH端為3′;磷酸基團末端為5′。6/252、DNA分子復(fù)制過程參加組分在DNA復(fù)制中作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制模板4種脫氧核苷酸合成子鏈原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物3′端開始連接脫氧核苷酸7/25解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸

思索：體內(nèi)DNA復(fù)制條件是什么？體外擴增DNA怎樣提供相同環(huán)境？

變性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高溫）20—30個核苷酸組成DNA或RNA8/25DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（遲緩冷卻）4、DNA分子熱變性原理：變性目標(biāo)：復(fù)性目標(biāo)：解開雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈結(jié)合9/25一、PCR原理（PCR技術(shù)原理）1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1~3步30輪3、DNA復(fù)制方向DNA合成方向總是從子鏈5’端向3’端延伸2、步驟：變性——復(fù)性——延伸10/25PCR技術(shù)原理總結(jié)

利用DNA分子熱變性原理，經(jīng)過控制溫度來控制雙鏈解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子擴增。

體外DNA復(fù)制條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液、嚴(yán)格控制溫度溫控設(shè)備。復(fù)制方向：子鏈5’端向3’端延伸。11/25二、PCR反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/12/255

引物15

引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制5

5

5

5

5

5

模板DNA5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA含量能夠擴大100萬（220）倍以上。13/25每個循環(huán)包含：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)產(chǎn)物也能夠作為模板參加反應(yīng)，而且由引物Ⅰ延伸而成DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA延伸，這么，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間DNA序列，使這段固定長度序列呈指數(shù)擴增。PCR反應(yīng)過程總結(jié)14/25三、PCR反應(yīng)試驗操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一個薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中液體，其上一次性吸液槍頭用一次更換一次實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度儀器15/25三、PCR反應(yīng)試驗操作（1）按配方將所需試劑擺放在試驗桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最終一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min16/25四、結(jié)果分析與評價DNA含量測定：稀釋→對照調(diào)零→測定→計算（公式見P63）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對照50倍17/25（一）理論上DNA擴增數(shù)目標(biāo)計算四、課題結(jié)果評價1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）試驗中DNA含量測定1、原理能夠經(jīng)過測量DNA含量來評價擴增效果，DNA在260nm紫外線波段有一強烈吸收峰，峰值大小與DNA含量相關(guān)18/252、過程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計讀數(shù)調(diào)整至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處光吸收值③測定并計算DNA含量（

g/mL）＝50×(260nm讀數(shù))×稀釋倍數(shù)19/2550：在厚度為1cm比色杯中吸光值為1,DNA

含量為50g/ml20/25體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)區(qū)分：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA普通用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞本身DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈一端開始復(fù)制。復(fù)制方向子鏈5’端向3’端延伸子鏈5’端向3’端延伸21/25課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段PCR原理DNA復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算22/25練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)應(yīng)用，錯誤一項是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定B診療遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診療遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定23/252、DNA合成方向總是從子鏈哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出優(yōu)點是A原理簡單B