從動(dòng)物肝臟組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶(由三個(gè)不同亞基組裝成為結(jié)合酶等電點(diǎn)為6.2)的技術(shù)路線

生物大分子的分離純化和

特定酶分離純化技術(shù)路線的設(shè)計(jì)16級(jí)長(zhǎng)學(xué)制臨床三班范佳祺常鈺涵趙瑾馮璞12目錄1.研究目的2.主要內(nèi)容3.研究方法和手段4.文獻(xiàn)綜述5.工作進(jìn)度安排6.預(yù)期成果22024/5/141.研究目的鍛煉自主學(xué)習(xí)和查閱文獻(xiàn)的能力鍛煉設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力32024/5/142.主要內(nèi)容自主設(shè)計(jì)從生物樣品中分離純化生物大分子的技術(shù)路線設(shè)計(jì)一個(gè)從動(dòng)物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶的技術(shù)路線并理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理42024/5/143.研究方法和手段研究方法：文獻(xiàn)研究法——搜集整理相關(guān)研究資料為研究做準(zhǔn)備研究手段：以傳統(tǒng)文獻(xiàn)檢索手段為主，輔以網(wǎng)絡(luò)、數(shù)據(jù)庫等手段，開展資料、搜集數(shù)據(jù)整理等工作52024/5/144.文獻(xiàn)綜述生物大分子的分類：蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類接下來分類講解如何從生物樣品中分離純化以上四類生物大分子的技術(shù)路線62024/5/144.1.1蛋白質(zhì)的分離純化分離方法：透析超濾除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物濃縮方法：丙酮沉淀、鹽析、免疫沉淀純化方法：電泳、層析72024/5/144.1.2核酸的分離純化——DNA①先將饑餓數(shù)天的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物殺死以除去肝糖原；②然后利用淀粉酶除去多糖；③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離；④利用去污劑或氯仿-戊/辛醇或苯酚處理后除去蛋白質(zhì)；⑤利用胰臟核糖核酸酶或鈣鹽或活性炭除去RNA。82024/5/144.1.2核酸的分離純化——RNA前四步與DNA的分離純化方法相同，之后可通過苯酚水溶液抽提或脫氧核糖核酸酶處理除去DNA?？稍倮弥鶎游?、梯度離心及逆流分溶等方法提取所需種類RNA。92024/5/144.1.3脂質(zhì)的分離純化利用FolchMethod從組織中分離和純化脂質(zhì)先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取組織液1:20的量和氯仿/甲醇一起組織勻漿，分層后在室溫下在搖床中搖動(dòng)15到20分鐘勻漿通過濾紙過濾或者離心獲得液體在離心獲得的液體中加入0.2倍體積（4ml）的水或者0.9%的生理鹽水渦旋幾秒鐘后混勻，然后2000rpm離心得到兩相溶液，通過虹吸去掉上層用作神經(jīng)節(jié)苷脂類的分析和有機(jī)小的極性分子的分析，如果需要的話用甲醇/水（1/1）的溶液將兩相界面洗一到兩次，洗的過程不要讓甲醇/水與下層混合通過離心和虹吸去掉上層后，下層氯仿相中含有脂質(zhì)，如果體積在2到3ml以下，則通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或在氮?dú)庀聺饪s102024/5/144.1.4糖類的分離純化提?。簞?dòng)物多糖和微生物多糖多有脂質(zhì)包圍，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進(jìn)行回流脫脂，釋放多糖。分離：分級(jí)沉淀法、金屬絡(luò)合物法、制備性區(qū)域電泳、色譜分離法和膜分離法。其中分級(jí)沉淀法主要有有機(jī)溶劑分步沉淀法、鹽析法及季銨鹽沉淀法；色譜分離法分為凝膠柱色譜和離子交換色譜法；膜分離法主要有超濾和微濾法。純化：Sevagr法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、鹽酸法、酶法、有機(jī)溶劑混合法除去蛋白質(zhì)。用透析法、柱離子交換法和纖維濾器透析法去離子。112024/5/144.2設(shè)計(jì)一個(gè)從動(dòng)物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶（該酶由三種不同的亞基組成，為結(jié)合酶，pI=6.2）的技術(shù)路線并理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理材料的選擇技材料的預(yù)處理術(shù)酶的提取路酶的分離線酶的純化酶純度的檢驗(yàn)122024/5/144.2.1材料的選擇因動(dòng)物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂質(zhì)、核酸的物質(zhì)，所以取饑餓24小時(shí)的動(dòng)物肝臟為實(shí)驗(yàn)材料。132024/5/144.2.2材料的預(yù)處理細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法?？蛇x用搗碎法或勻漿法。使用勻漿法時(shí)應(yīng)先將大塊的組織或者細(xì)胞團(tuán)用組織搗碎機(jī)或研磨器械搗碎分散。防止蛋白酶的水解作用：預(yù)防的措施是加入蛋白酶抑制劑。常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。142024/5/144.2.3酶的提取鹽溶液提取：適用于大多數(shù)酶。鹽溶現(xiàn)象：大多數(shù)P酶在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加。鹽析現(xiàn)象：在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低。152024/5/144.2.4酶的分離等電點(diǎn)沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故適宜采用此種方法進(jìn)行分離。等電點(diǎn)沉淀法：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，及不同兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)不同這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法。在溶液的pH值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來。因此可以通過調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH，把目的酶和雜蛋白分開。但由于蛋白質(zhì)在pI點(diǎn)附件一定范圍的pH內(nèi)都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，而且相當(dāng)多的蛋白質(zhì)的pI點(diǎn)很靠近，所以該法的回收率和純化倍數(shù)都不理想，一般只用于酶的粗分離階段。162024/5/144.3.5酶的純化結(jié)晶：鹽析結(jié)晶法——加固體鹽法、飽和鹽溶液、透析擴(kuò)散法。濃縮：真空蒸發(fā)濃縮——在一定的真空條件下，使酶液在60℃以下汽化蒸發(fā)，進(jìn)行濃縮的過程。一般說來，在不影響酶活力的前提下，適當(dāng)提高溫度、降低壓力、增大蒸發(fā)面積都可以使蒸發(fā)速度提高。干燥：真空干燥法——真空干燥是在與真空系統(tǒng)相連接的密閉干燥器中，一邊抽真空一邊加熱，使酶液在較低的溫度條件下蒸發(fā)干燥的過程。在真空泵之前需要設(shè)置水蒸氣凝結(jié)收集器，以免汽化產(chǎn)生的水蒸氣進(jìn)入真