第05章食品中化學(xué)物質(zhì)的一般毒性作用及評(píng)價(jià)

第五章食品中化學(xué)物質(zhì)的

一般毒性作用及評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)目的與要求掌握：一般毒性作用的概念、試驗(yàn)的目的；急性毒性的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；蓄積作用的概念。熟悉：一般毒性試驗(yàn)方法的要點(diǎn)；蓄積毒性試驗(yàn)方法。了解：LD50的計(jì)算方法。毒性作用？一般毒性作用：也稱基礎(chǔ)毒性作用，指外源性化學(xué)物在一定的劑量、一定的接觸時(shí)間和一定的接觸方式下對(duì)機(jī)體（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類）產(chǎn)生綜合毒效應(yīng)的能力?？煞譃榧毙远拘宰饔谩喡远拘宰饔煤吐远拘宰饔?。蓄積毒性特殊毒性作用：包括致突變、致癌、致畸，簡(jiǎn)稱為“三致”。第一節(jié)急性毒性作用新外源化合物首先需必須闡明其急性毒性的強(qiáng)度及特征。一、基本概念和目的二、急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)三、急性毒性評(píng)價(jià)四、LD50應(yīng)用中的有關(guān)問(wèn)題五、急性毒性替代試驗(yàn)一、概念和試驗(yàn)?zāi)康?．概念急性毒性（acutetoxicity）是指機(jī)體（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人）一次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸一定劑量外源化學(xué)物后在短期（最長(zhǎng)到14天）所引起的機(jī)體的毒性效應(yīng)（包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化等），以及死亡效應(yīng)。實(shí)際工作中，機(jī)體接觸化學(xué)毒物的方式或途徑不同，急性接觸的含義也有所不同。一次接觸是指瞬間給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，如經(jīng)口染毒、經(jīng)注射途徑染毒。經(jīng)呼吸道與經(jīng)皮膚染毒而言，則是指在一個(gè)特定的期間使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)地接觸化學(xué)物的過(guò)程。當(dāng)化學(xué)物毒性很低，需要給予動(dòng)物較大劑量時(shí)，可在24小時(shí)內(nèi)分多次給予，這時(shí)的急性接觸即為“多次”，一般不超過(guò)三次。急性接觸的時(shí)間和次數(shù)中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間急性毒性效應(yīng)一般是指機(jī)體接觸化學(xué)物后，在較短時(shí)間內(nèi)觀察到的毒性癥狀。有的化學(xué)毒物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸幾分鐘內(nèi)即可產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀，甚至瞬間死亡；而有些化學(xué)毒物幾天、十幾天后動(dòng)物才產(chǎn)生明顯的中毒癥狀和死亡，呈現(xiàn)遲發(fā)毒效應(yīng)。有的化學(xué)毒物在出現(xiàn)快速和劇烈的毒效應(yīng)后很快恢復(fù)；有的化學(xué)物早期僅有較輕微癥狀，幾天后又出現(xiàn)嚴(yán)重中毒癥狀甚至死亡。在實(shí)際工作中，大部分毒物的急性毒性癥狀在短期內(nèi)出現(xiàn)，一般為7~14天。2．急性毒性試驗(yàn)的目的測(cè)定毒物的致死劑量以及其他急性毒性參數(shù)，LD50為最主要的參數(shù)，并根據(jù)LD50值進(jìn)行急性毒性分級(jí)。其他毒性參數(shù)還有LD100、LD01、LD0等。通過(guò)觀察動(dòng)物中毒表現(xiàn)，毒作用強(qiáng)度和死亡情況，初步評(píng)價(jià)毒物對(duì)機(jī)體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）和對(duì)人類的潛在危險(xiǎn)性程度。為重復(fù)劑量、亞慢性和慢性毒性研究及其他毒性試驗(yàn)提供接觸劑量的設(shè)計(jì)依據(jù)，并為觀察指標(biāo)的選擇提出建議。為毒理學(xué)機(jī)制研究提供初步線索。

3．有關(guān)急性毒性試驗(yàn)常見(jiàn)的參數(shù)急性毒性上限參數(shù)，以死亡為終點(diǎn)：半數(shù)致死劑量或濃度（LD50或LC50）；絕對(duì)致死劑量或濃度（LD100或LC100）；最小致死劑量或濃度（MLD，LD01或MLC，LC01）；最大耐受劑量或濃度（MTD，LD0或MTC），或稱為最大非致死劑量（MNLD）。急性毒性下限參數(shù)，以非致死性急性毒作用為終點(diǎn)：觀察到有害作用的最低水平（急性毒性LOAEL）；未觀察到有害作用的水平（急性毒性NOAEL）。因此，急性毒性試驗(yàn)可以分為兩類。一類是以死亡為終點(diǎn)，以檢測(cè)受試物急性毒性上限指標(biāo)為目的的試驗(yàn)，這類試驗(yàn)主要是求得受試物的LD50值。另一類急性毒性試驗(yàn)檢測(cè)非致死性指標(biāo)。1.試驗(yàn)動(dòng)物的選擇和要求2.動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境3.染毒方法4.劑量選擇及分組5.試驗(yàn)周期6.毒性觀察7.LD50的計(jì)算方法二、急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)一般原則：毒性反應(yīng)與人相近；操作方便，易飼養(yǎng)和管理；品系純，價(jià)格低，易獲?。贿x擇兩種以上動(dòng)物分別求其急性毒作用參數(shù)。其他條件選擇：年齡：剛成年的健康動(dòng)物；性別：雌、雄各半；雌、雄分籠喂養(yǎng)；分組：隨機(jī)分組；檢疫期：1~2周，如是貓、狗，則須檢查腸道寄生蟲(chóng)或直接驅(qū)蟲(chóng)治療。1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和要求一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在22±3℃，家兔可控制在20±3℃，相對(duì)濕度30%-70%，無(wú)對(duì)流風(fēng)。每籠動(dòng)物數(shù)（飼養(yǎng)密度）以不干擾動(dòng)物個(gè)體活動(dòng)及不影響試驗(yàn)觀察為度，必要時(shí)單籠喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室采用人工晝夜為好，早6點(diǎn)至晚6點(diǎn)進(jìn)行12小時(shí)光照，其余時(shí)間黑暗。一般食用常規(guī)試驗(yàn)飼料，自由飲水。墊料合格，室內(nèi)衛(wèi)生。2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染毒方法經(jīng)皮膚注射途徑喂飼法灌胃

吞咽膠囊

靜式吸入動(dòng)式吸入經(jīng)口經(jīng)呼吸道4．劑量選擇有分組（1）查閱文獻(xiàn)了解化學(xué)毒物的結(jié)構(gòu)、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、密度、閃點(diǎn)、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號(hào)及純度，雜質(zhì)成分與含量等。確定使用哪種方法計(jì)算LD50，然后再設(shè)計(jì)劑量分組。LD50的計(jì)算方法常用改良寇氏法、概率單位法、霍思法等。找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動(dòng)物種系和相同接觸途徑所測(cè)得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。設(shè)定以此預(yù)期值作為待測(cè)化學(xué)物的中間劑量組，并在該劑量的上下各設(shè)計(jì)l一2個(gè)劑量組作為預(yù)試驗(yàn)劑量。根據(jù)確定的劑量組進(jìn)行染毒。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的死亡資料確定組距。（2）預(yù)試驗(yàn)可根據(jù)以下公式計(jì)算出劑量分組：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)式中i為組距(相鄰的兩個(gè)劑量組對(duì)數(shù)劑量之差)；n為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)所選用的LD50計(jì)算方法來(lái)確定組數(shù)。例如幾率單位法、寇氏法一般設(shè)6～10個(gè)劑量組；霍恩法固定設(shè)4個(gè)劑量組。求得i值后．以最低劑量組(LD0或LD10)的對(duì)數(shù)劑量加上一個(gè)i值，即是第二個(gè)劑量組的對(duì)數(shù)劑量，依此類推直至最高劑量組，查各自的反對(duì)數(shù)即得出各組劑量的真實(shí)值。

12345LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i???（3）正式試驗(yàn)5．試驗(yàn)周期急性毒性試驗(yàn)除計(jì)算受試物的LD50/LC50外，還需要通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒癥狀判斷受試物的毒作用性質(zhì)，推斷中毒的靶器官等。因此，試驗(yàn)周期一般為2周。一般要求的觀察時(shí)間為14天許多化學(xué)物在動(dòng)物接觸后很快死亡，如氰化物。也有些化學(xué)物所致的中毒癥狀發(fā)展遲緩，可出現(xiàn)遲發(fā)性死亡，如有機(jī)磷農(nóng)藥中毒-腦病。另外，由于動(dòng)物個(gè)體差異，死亡時(shí)間也不同。如小鼠腹腔注射過(guò)氧化二碳酸二環(huán)己酯（DCPD），同一組動(dòng)物的最早死亡時(shí)間為注射后7h，最遲為150h（6d）。6．毒性觀察（1）觀察時(shí)間注意：任何LD50或相關(guān)參數(shù)測(cè)定，均應(yīng)標(biāo)明接觸時(shí)間。目的：觀察外源化學(xué)物急性毒性的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)可以彌補(bǔ)LD50參數(shù)的不足。內(nèi)容：中毒的發(fā)生、發(fā)展、規(guī)律；體重改變；死亡前癥狀、特點(diǎn)；死亡時(shí)間等。（2）癥狀觀察嚙齒類動(dòng)物化學(xué)物中毒主要觀察內(nèi)容

系統(tǒng)和器官中毒后常見(jiàn)表現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)體位異常,叫聲異常,活動(dòng)增多,呆臥少動(dòng),肌顫,痙攣,抽搐麻痹,后肢無(wú)力,運(yùn)動(dòng)失調(diào),管狀尾,對(duì)外界刺激過(guò)敏或遲鈍植物神經(jīng)系統(tǒng)瞳孔擴(kuò)大,流口水,流淚,出汗呼吸系統(tǒng)鼻孔溢液,鼻翼煽動(dòng),呼吸深緩,呼吸過(guò)速,張口或腹式呼吸泌尿生殖系統(tǒng)會(huì)陰部污穢,有分泌物,陰戶或乳腺腫脹,陰莖突出,遺精皮膚和被毛皮膚充血,紫紺,被毛蓬松,污穢眼睛眼球突出,充血,角膜渾濁,血性分泌物體重改變可以反映動(dòng)物染毒后的整體變化。若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕。若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會(huì)減輕。如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可以在體重上反映出來(lái)。對(duì)存活動(dòng)物尤其是對(duì)低于LD50劑量組的存活動(dòng)物．應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化．以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。（3）體重測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒后的死亡時(shí)間也應(yīng)記錄和分析，死亡時(shí)間的分析可以提供一些重要信息。久效磷小鼠經(jīng)口與腹腔注射染毒，均呈現(xiàn)隨染毒劑量增加，死亡時(shí)間縮短，死亡時(shí)間與染毒劑量之間呈直線負(fù)相關(guān)，提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致死是可能由于化學(xué)物原形所致。DCPD給大鼠腹腔注射染毒，染毒劑量對(duì)數(shù)值與死亡時(shí)間呈明顯負(fù)相關(guān)；但給小鼠腹腔注射染毒，則無(wú)明顯相關(guān)。可能與化學(xué)物在大鼠和小鼠體內(nèi)代謝不同有關(guān)。（4）死亡時(shí)間對(duì)死亡的動(dòng)物應(yīng)及時(shí)做大體解剖檢查和病理組織學(xué)檢查，觀察內(nèi)臟器官大小、外觀、色澤的變化，有無(wú)充血、出血、水腫或其它改變，有無(wú)充血、出血、水腫、壞死等改變，對(duì)有變化的器官應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。如果有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，應(yīng)以此為線索，進(jìn)行下一步研究，為之后的亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)提供參考觀察指標(biāo)。對(duì)存活動(dòng)物在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行大體病理檢查．必要時(shí)做組織病理學(xué)檢查。根據(jù)試驗(yàn)需要可進(jìn)一步擴(kuò)大觀察項(xiàng)目，如體溫、心電圖、腦電圖或進(jìn)行某些生化指標(biāo)測(cè)定等。（5）病理檢查三、急性毒性評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)外來(lái)化學(xué)物急毒的強(qiáng)弱及對(duì)人類的潛在危害程度，國(guó)際上提出了化學(xué)物急毒的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)用以對(duì)急毒進(jìn)行評(píng)價(jià)。為便于比較化學(xué)物的毒性及有毒化學(xué)物的管理，國(guó)內(nèi)外根據(jù)LD50的大小提出了許多分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。但分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一。不管是國(guó)際、國(guó)內(nèi)制定的標(biāo)準(zhǔn)都存在不少的缺點(diǎn)和不足，尚有待改進(jìn)。

注意：急毒不大，慢毒可能很大。因此不能將急毒分級(jí)與慢毒分級(jí)混淆。毒性分級(jí)

外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)(WHO)

毒性分級(jí)大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)六只大鼠吸入4小時(shí)死亡2~4只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)對(duì)人可能致死的估計(jì)量g/kg總量(g/60kg)劇毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250微毒5000~10000~2180~>15>1000化學(xué)物經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（我國(guó)，1994）

急性毒性分級(jí)大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)大約相當(dāng)70kg人的致死劑量6級(jí),極毒<1稍嘗,<7滴5級(jí),劇毒1~507滴~~1茶匙4級(jí),中等毒51~5001茶匙~35克3級(jí),低毒501~500035~350克2級(jí),實(shí)際無(wú)毒5001~15000350~1050克1級(jí),無(wú)毒>15000>1050克四、LD50應(yīng)用中的有關(guān)問(wèn)題1927年Trevan引入了半數(shù)致死量LD50（LC50）的概念來(lái)評(píng)價(jià)急性毒性，此后該指標(biāo)得到廣泛應(yīng)用，并成為急性毒性的主要指標(biāo)。在藥物研究中，評(píng)價(jià)藥物急毒的大小，比較不同藥物毒性的大??；計(jì)算藥物的治療指數(shù)；為后續(xù)的重復(fù)給藥毒理學(xué)試驗(yàn)提供劑量參考；比較不同途徑的LD50值，獲得生物利用度的信息；試驗(yàn)中毒量及其體征為臨床不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考。1．LD50具有重要的毒理學(xué)意義LD50（LC50）是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，它受到許多因素的影響，包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的物種、品系、性別、年齡、受試化學(xué)物的濃度、稀釋溶液的性質(zhì)、喂養(yǎng)條件以及操作者的熟練程度等。因此，在比較不同實(shí)驗(yàn)室的LD50時(shí)要考慮到各種影響因素的存在，以及實(shí)驗(yàn)條件的等同性。另外，即使各個(gè)條件都相同，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抽樣誤差，LD50的差別依然存在。2．LD50的波動(dòng)性同一化學(xué)物不同實(shí)驗(yàn)室LD50測(cè)定結(jié)果的差異

染毒途徑毒物總數(shù)平均差異倍數(shù)最大差異倍數(shù)經(jīng)口20513吸入203.811皮下301.874.8經(jīng)皮未說(shuō)明1.744腹腔251.251.8化合物范圍（mg/kg）比值（max/min）五氯酚74~6208.38水楊酸鈉930~23282.50苯胺479~11692.44乙酰苯胺723~30604.23氯化鎘105~4824.59曾經(jīng)有研究組織13個(gè)國(guó)家的11個(gè)實(shí)驗(yàn)室，統(tǒng)一主要的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)5種化學(xué)物的LD50進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)收集到的80個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，結(jié)果仍存在相當(dāng)大的差別，可達(dá)2.44~8.38倍。LD50（LC50）雖然是一個(gè)重要的急性毒性參數(shù)，但它只能表示一種外源化學(xué)物引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡一半的劑量(或濃度)，不能反映急性毒性作用的特征，也不能反映其毒作用帶的寬或窄。為彌補(bǔ)LD50（LC50）的不足，實(shí)驗(yàn)中還要詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒特征，并選擇其它的參數(shù)，如急性毒作用帶。3．LD50的局限性消耗的動(dòng)物量大；獲得的信息有限；測(cè)得的LD50僅僅是一個(gè)近似值；在安全性評(píng)價(jià)中僅評(píng)價(jià)動(dòng)物死亡和簡(jiǎn)單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗(yàn)檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。五、經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)的局限性急性毒性替代試驗(yàn)（P141）第二節(jié)亞慢性和慢性毒性作用和評(píng)價(jià)一、基本概念及試驗(yàn)?zāi)康亩?、亞慢性毒性試?yàn)設(shè)計(jì)三、慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)四、亞慢性、慢性毒性作用評(píng)價(jià)一、基本概念及試驗(yàn)?zāi)康?．亞慢性、慢性毒性作用的概念慢性毒性作用：指人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期（終生）反復(fù)接觸外源化學(xué)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。亞慢性毒性作用：指人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物連續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間接觸較大劑量的外來(lái)化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。2．亞慢性、慢性毒性作用的試驗(yàn)?zāi)康模≒147）確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜，對(duì)在急性及亞急性毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)的毒作用；研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官；研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量—反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL），提出此受試物的安全限量參考值;研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性；亞慢性毒性試驗(yàn)為慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)及觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)；確定不同動(dòng)物物種對(duì)受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。二、亞慢性和慢性毒性作用及評(píng)價(jià)亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)亞慢性、慢性毒性作用評(píng)價(jià)1．亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)動(dòng)物的選擇試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境劑量的選擇與分組染毒途徑試驗(yàn)周期觀察指標(biāo)原則上要求對(duì)受試物代謝過(guò)程基本與人類相似,應(yīng)當(dāng)是急性毒性試驗(yàn)已證明的對(duì)受試物敏感的種屬和品系,同時(shí)還應(yīng)考慮與慢性毒作用試驗(yàn)中預(yù)計(jì)使用的動(dòng)物種屬和品系相同。若無(wú)法掌握這一情況，則應(yīng)有兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為嚙齒類，另一為非嚙齒類，以便了解受試物毒性特征。也應(yīng)參考觀察指標(biāo)的需要而選擇，如需多次抽血檢查則不宜用小鼠。性別選擇一般雌雄兼用，特殊試驗(yàn)可選用單性別動(dòng)物。如對(duì)性腺影響試驗(yàn)。年齡選擇大鼠4周，重50克；小鼠3周，重10克。（1）試驗(yàn)動(dòng)物的選擇在亞慢性試驗(yàn)期間，動(dòng)物飼養(yǎng)條件及環(huán)境可能影響毒性效應(yīng)，應(yīng)注意營(yíng)養(yǎng)平衡和環(huán)境的穩(wěn)定，必須有營(yíng)養(yǎng)合理的飼料、充足干凈的飲水和清潔的生活環(huán)境。并保持適宜的溫度和濕度，以保證動(dòng)物健康。當(dāng)受試驗(yàn)物在飼料中的比例較高（大于5%）時(shí)，須考慮其可食性及營(yíng)養(yǎng)平衡問(wèn)題，還要避免經(jīng)胃腸代謝后的毒物又被動(dòng)物攝取而影響試驗(yàn)結(jié)果。不同物種的動(dòng)物應(yīng)分室飼養(yǎng)，籠具要保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由活動(dòng)，必要時(shí)單籠飼養(yǎng)，且應(yīng)有人工晝夜設(shè)施。（2）試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境所選劑量上限應(yīng)在試驗(yàn)期不引起動(dòng)物死亡或個(gè)別死亡，但要有明顯的中毒效應(yīng)或靶器官出現(xiàn)明顯損傷?？蓞⒖技倍驹囼?yàn)的閾劑量為其上限，也可用1/20-1/5LD50。亞慢性試驗(yàn)應(yīng)求量-效關(guān)系，因此至少設(shè)置3-4個(gè)劑量組、1個(gè)正常對(duì)照組，必要時(shí)加1個(gè)溶劑對(duì)照組。每組動(dòng)物大鼠20-40只、家兔10-20只、狗6-8只、猴2-4只，若試驗(yàn)中期需處死部分動(dòng)物作病理解剖檢查時(shí)應(yīng)相應(yīng)增加動(dòng)物例數(shù)。（3）劑量的選擇與分組染毒途徑先要盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該受試物的途徑和方式，其次應(yīng)與后來(lái)預(yù)期要進(jìn)行的慢毒試驗(yàn)的接觸途徑一致。經(jīng)口接觸一般采用飼喂法。但應(yīng)注意動(dòng)物厭食或拒食。經(jīng)呼吸道吸入接觸的時(shí)間隨所接觸受試物而定，如為工業(yè)毒物可接觸1-4小時(shí)，環(huán)境污染則可適當(dāng)延長(zhǎng)至4-8小時(shí)。每日接觸受試物應(yīng)定時(shí)，以減小接觸量和反應(yīng)誤差。（4）染毒途徑試驗(yàn)周期一般占實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的1/10。因?yàn)椴煌瑒?dòng)物的壽命不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期有所不同，從幾個(gè)月至1年不等。一般對(duì)長(zhǎng)周期、經(jīng)常接觸的受試物可選擇90天試驗(yàn)周期，而對(duì)階段性接觸的受試物可選擇30天。（5）試驗(yàn)周期亞慢性試驗(yàn)中觀察指標(biāo)比較廣泛，其選擇十分重要。常根據(jù)急性、蓄積性試驗(yàn)提供的線索及相關(guān)資料，選擇一些特異和非特異指標(biāo)，包括一般性指標(biāo)、血液和行為學(xué)檢查、生理生化指標(biāo)、病理解剖學(xué)與病理組織學(xué)檢查及器官系數(shù)測(cè)定等。一般指標(biāo)病理學(xué)檢查特異指標(biāo)（6）觀察指標(biāo)一般指標(biāo)為非特異指標(biāo)，是外來(lái)化學(xué)物對(duì)機(jī)體毒性作用的綜合性總體反映。主要包括：動(dòng)物體重：反映化學(xué)物對(duì)消化系統(tǒng)和代謝的影響。食物利用率：攝食量與體重的增長(zhǎng)比率。同樣反映化學(xué)物對(duì)消化系統(tǒng)和代謝的影響。癥狀：主要有毛色、眼分泌物、呼吸、神態(tài)及行為。臟器系數(shù)：臟器濕重與體重的比率?？煞从尘唧w受損的器官。一般生化指標(biāo)：主要是血象和肝腎功能指標(biāo)。病理學(xué)檢查凡是在染毒過(guò)程中死亡的動(dòng)物，均應(yīng)即使解剖進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，必要時(shí)作組織化學(xué)或電鏡檢查。檢查時(shí)所選臟器應(yīng)參照急性毒性試驗(yàn)的臟器改變或亞慢性毒性試驗(yàn)的中毒癥狀而定。必要時(shí)可進(jìn)行所有臟器的病理組織學(xué)檢查。特異指標(biāo)特異指標(biāo)是指對(duì)機(jī)體亞慢性毒性作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)。其與受試物的中毒機(jī)制密切相關(guān)。指標(biāo)選定一是全面分析受試物急性毒作用特征，初步發(fā)現(xiàn)主要危害的系統(tǒng)、器官和組織，來(lái)發(fā)現(xiàn)一些敏感或特異性指標(biāo)；另一方面是通過(guò)文獻(xiàn)檢索，參考一些化學(xué)物的同系物、某些特殊基團(tuán)具有的特定毒性，利用構(gòu)效關(guān)系的共性來(lái)選擇特異性指標(biāo)。慢毒試驗(yàn)是制定人體日允許攝入量所需的關(guān)鍵性資料。2．慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)因慢毒試驗(yàn)為動(dòng)物的大部分生命周期甚至終身，因此只能選用生命周期較短(2~3年)的動(dòng)物。又要對(duì)飼養(yǎng)條件、生化系統(tǒng)、繁殖、自發(fā)性疾病均有比較系統(tǒng)的了解，故傳統(tǒng)上選用大鼠（3-4周，50-70克）、小鼠（3周，10-12克）。并要求品系明確一致（取決于被檢物的毒作用部位及毒劑量的總的敏感性，一般選對(duì)致癌物敏感的品系），雌雄各半。動(dòng)物數(shù)量要求與亞慢性毒性試驗(yàn)相似。（1）試驗(yàn)動(dòng)物的選擇飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)環(huán)境要求與亞慢性毒性試驗(yàn)相同，如應(yīng)保證試驗(yàn)動(dòng)物有溫濕度適宜的生活環(huán)境及合理的營(yíng)養(yǎng)。注意動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)成分可影響慢毒試驗(yàn)的結(jié)果，如半合成飼料可增加致癌物的敏感性，黃酮類及大蒜素相反。（2）試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境試驗(yàn)分零劑量組、預(yù)期無(wú)作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生輕微但有明確毒效應(yīng)劑量組和發(fā)生明顯的毒效應(yīng)甚至亞致使死水平劑量組，以求量效關(guān)系。必要時(shí)加溶劑對(duì)照組。劑量選擇參考：①亞慢毒試驗(yàn)結(jié)果：高劑量組為1/5-1/2閾劑量，輕微毒效應(yīng)組為1/20-1/10閾劑量，慢毒閾劑量組為1/50-1/20閾劑量，預(yù)期無(wú)作用劑量組為1/10最大無(wú)作用量、1/100閾劑量或10-50倍人群實(shí)際最大攝入量。②急毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果：高劑量組為1/10LD50，慢毒閾劑量組為1/100LD50，預(yù)期無(wú)作用劑量組為1/1000LD50。③美國(guó)環(huán)保局建議：0.125MTD和0.25MTD。MTD(最大耐受量):試驗(yàn)組動(dòng)物較對(duì)照組動(dòng)物體重減輕不超過(guò)10%、無(wú)死亡、無(wú)中毒癥狀和病理?yè)p傷的最大量。（3）劑量的選擇與分組慢毒試驗(yàn)多采用經(jīng)胃腸道與呼吸道接觸。經(jīng)胃腸道接觸一般將受試物與食物或飲水混合，由動(dòng)物自然攝入。但若受試物有異味或易水解時(shí)可采用每日定時(shí)灌胃。經(jīng)呼吸道接觸，依試驗(yàn)要求定每日接觸時(shí)間，如為工業(yè)毒物的試驗(yàn)通常要求每日吸入4-6小時(shí)，如為環(huán)境污染物一般要求每日吸入8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。（4）染毒途徑其依試驗(yàn)的要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類而定。使用大、小鼠時(shí)，工業(yè)毒理學(xué)要求6個(gè)月；食品和環(huán)境毒理學(xué)一般要求1年以上至2年。若與致癌試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行，則最好長(zhǎng)達(dá)接近動(dòng)物的預(yù)期壽命，甚至終生。有人認(rèn)為大鼠90天試驗(yàn)即可確定慢性無(wú)作用水平；也有主張終生接觸才能全面反映受試物的慢毒效應(yīng)及求出閾劑量或無(wú)作用量。（5）試驗(yàn)期限應(yīng)以亞慢毒試驗(yàn)的觀察指標(biāo)為基礎(chǔ)，選擇亞慢毒試驗(yàn)中已呈現(xiàn)有意義的變化指標(biāo)。一般常規(guī)觀察指標(biāo)包括肝、腎功能，健康狀況、體重、血液及其它生化指標(biāo)。對(duì)死亡動(dòng)物及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)作病檢。為減小誤差和排除陋檢，應(yīng)注意：試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)觀察指標(biāo)進(jìn)行正常值檢查，剔除差異大的動(dòng)物；觀察應(yīng)與對(duì)照組同步進(jìn)行并作對(duì)比；檢測(cè)方法應(yīng)穩(wěn)定，并有質(zhì)量控制；應(yīng)在不同間隔（于6、12、18個(gè)月）處死部分動(dòng)物檢測(cè)，以了解是否有進(jìn)行性和可逆性變化。（6）觀察指標(biāo)三、亞慢性、慢性毒性作用評(píng)價(jià)了解受試物毒性的大小及靶器官，并找出敏感的毒效應(yīng)指標(biāo)，即最早出現(xiàn)在最低劑量組并與對(duì)照組比較差異有顯著性的毒效應(yīng)指標(biāo)。1．基本評(píng)價(jià)參數(shù)敏感毒效應(yīng)指標(biāo)出現(xiàn)改變的最小劑量。用最低有害作用水平（lowestobservedadverseeffectlevel，LOAEL）表達(dá)。最大無(wú)作用量（不引起機(jī)體某種毒效應(yīng)的最大劑量）。用無(wú)明顯有害水平（NOAEL）表達(dá)。LOAEL或NOAEL是評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)機(jī)體損害的主要指標(biāo)，但應(yīng)注明動(dòng)物、試驗(yàn)條件及觀察指標(biāo)。以此為基本可制定化學(xué)物的接觸極限。2．亞慢性毒性作用評(píng)價(jià)我國(guó)《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》規(guī)定：最大無(wú)作用劑量小于或等于人可能攝入量的100倍，則表示毒性很強(qiáng)，應(yīng)放棄該化學(xué)物的使用；若最大無(wú)作用劑量在100-300倍之間，可進(jìn)行慢毒試驗(yàn)；若大于或等于300倍，則不必進(jìn)行慢毒試驗(yàn)，可直接進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。3．慢性毒性作用評(píng)價(jià)如慢毒試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)致癌性：最大無(wú)作用劑量小于或等于人群的可能攝入量的50倍，表示毒性較強(qiáng)