食品中常規(guī)項目的微生物檢驗

8.3食品中常規(guī)項目的微生物檢驗

2021/5/918.3.1食品中菌落總數(shù)的測定菌落總數(shù)的定義菌落總數(shù)：是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1mL或1cm2表面積檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。2021/5/92

測定原理：菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)溫度和時間，PH，需氧性質(zhì)等），所得1ml(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在培養(yǎng)瓊脂上生長的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。2021/5/93一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)或均技術(shù)的技術(shù)方法；2、掌握食品細(xì)菌總數(shù)的測定報告方式。二、實驗材料1、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、托盤天平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、滅菌刀或剪刀、滅菌鑷子、75%酒精棉球、玻璃蠟筆、登記薄2、培養(yǎng)基和試劑：75%乙醇、生理鹽水、15%氫氧化鈉溶液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基實驗二食品中細(xì)菌總數(shù)的測定2021/5/941、檢驗程序菌落總數(shù)檢驗程序：

檢樣→做成幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液→選擇2-3個適宜稀釋度各以1ml之量分別入滅菌平皿內(nèi)→每皿內(nèi)加入460C適量營養(yǎng)瓊脂→菌落數(shù)→報告三、實驗方法2021/5/95（1）以無菌操作，將檢樣25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000r/min~100000r/min的速度處理1min，做成1：10的均勻稀釋液。（2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。（3）另取1ml的滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。2、檢樣稀釋及培養(yǎng)2021/5/96（4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。（5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至460C營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[可放置在（（46±1）0C）水浴鍋內(nèi)保溫]注入平皿15ml～20mL，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。（6）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（36±1）0C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（48±2）h取出，計算平板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得1g（1mL）樣品所含菌落總數(shù)。

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3、菌落計算方法（1）菌落計數(shù)方法做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。（2）菌落計數(shù)的報告①平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個菌落數(shù)；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個菌落計。2021/5/98②稀釋度的選擇應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。若有兩上稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300之間，則視兩者之比如何來決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若大于2則報告其中較小的數(shù)字。若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。2021/5/99

若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。③菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。2021/5/9102021/5/9112021/5/9122021/5/9132021/5/9148.3.2食品中大腸菌群的測定大腸菌群的定義:大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃24h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。2021/5/915大腸菌群=大腸桿菌嗎？大腸菌群包括大腸桿菌。大腸菌群指能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰型無芽孢桿菌。大腸埃希氏菌(E.coli)習(xí)慣稱為大腸桿菌，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。2021/5/916大腸菌群的衛(wèi)生意義大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。2021/5/917國標(biāo)法國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察是否產(chǎn)氣。

分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。

證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。

報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。2021/5/918實驗三食品中大腸菌群的測定一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序、方法；2、掌握食品中大腸菌群檢測結(jié)果的報告方式。二、實驗材料1、設(shè)備和材料溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針2、培養(yǎng)基及試劑乳糖—膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱、伊紅美藍瓊脂（EMB）、遠(yuǎn)騰氏瓊脂、革蘭氏染色液2021/5/919三、實驗方法與步驟1、采樣及稀釋①以無菌操作將檢樣25g（或25ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器，以8000r/min～10000r/min的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。②用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液2021/5/920③根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗樣品污染情況估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。2.乳糖初發(fā)酵試驗即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個稀釋度接種3管，置（36±1）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（24±2）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進行2021/5/9213.分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置（36±1）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗。4.乳糖復(fù)發(fā)酵試驗即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酵管試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。

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在上述的選擇性培養(yǎng)基上，挑取可疑大腸菌群1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置（36±1）0C的溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24±2）h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，即報告為大腸桿菌陽性；凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色為陽性，則報告為大腸桿菌為陰性。5.報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100ml（g）食品中大腸菌群的最可能數(shù)。2021/5/9232021/5/9242021/5/9258.3.3糞大腸菌群的檢驗

根據(jù)國家頒布的食品衛(wèi)生微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法(GB4789.3-1994)，糞大腸菌群系指一群能在44℃24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和利用色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。表8-3中的大腸艾希氏菌I型即屬糞大腸菌群。糞大腸菌群的唯一來源是糞便，因此，唯有糞大腸菌群是糞便污染的確切指標(biāo)。在被檢樣品中，如果有糞大腸菌群存在，則在大腸菌群檢驗中也被計入。因此，也有將大腸菌群數(shù)稱為總大腸菌群數(shù)者。2021/5/9268.3.4沙門氏桿菌的檢驗沙門氏桿菌是一群形態(tài)和培養(yǎng)特性都類似的腸桿菌科中的一個大屬，也是腸桿菌科中最重要的病原屬，它包括將近2000個血清型。沙門氏菌病常在動物中廣泛傳播，人的沙門氏菌感染和帶菌也非常普遍。由于動物的生前感染或食品受到污染，均可使人發(fā)生食物中毒。世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位。沙門氏菌常作為進出口食品和其他食品的致病菌指標(biāo)。因此，檢查食品中的沙門氏菌極為重要。2021/5/9278.3.5志賀氏桿菌的檢驗志賀式菌屬的細(xì)菌通稱為痢疾桿菌，是細(xì)菌性痢疾的病原菌。臨床上能引起痢疾癥狀的病原微生物很多，如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、艾希氏菌屬等，還有阿米巴原蟲、鞭毛蟲及病毒等均可引起人類痢疾，其中以志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾最為常見。人類對志賀氏菌的易感性較高，所以在食物和飲用水的衛(wèi)生檢驗時，常以是否含有志賀氏菌作為指標(biāo)。志賀氏菌屬是由四個亞群組成，即