原位雜交探針的制備

原位雜交探針制備步驟1.轉(zhuǎn)錄模板的選?。哼x取目的基因中150-1200bp長(zhǎng)短的無(wú)ployA尾巴的非保守區(qū)段為模板。如果模板長(zhǎng)度大于500bp,雜交前需要將探針進(jìn)行溫和堿水解，小于500bp探針雜交前則可不進(jìn)行堿解。2.轉(zhuǎn)錄模板的制備：因?yàn)檗D(zhuǎn)錄模板的純度直接影響著探針合成的質(zhì)量和數(shù)量，所以一般用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒。首先，將模板DNA片斷連接到pGEM-Teasy克隆載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切或PCR鑒定甚至測(cè)序以后，挑取目的克?。０遄詈脼榉聪蜻B接，將來(lái)用T7轉(zhuǎn)錄酶合成anti－sense探針，用SP6轉(zhuǎn)錄酶合成sense探針。模板正向連接時(shí)用SP6轉(zhuǎn)錄酶合成anti－sense探針，用T7轉(zhuǎn)錄酶合成sense探針）于30mlLB液體培養(yǎng)基(含50mg/lAmp)中37℃,200rpm過(guò)夜（約16小時(shí)）。待菌液濃度約為5.0A600U/ml時(shí)可以提取質(zhì)粒。3.轉(zhuǎn)錄模板線性化：先取少量的質(zhì)粒溶液，用載體上的合適的多克隆位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切。限制性?xún)?nèi)切酶切斷后必須為5'突出或平端,嚴(yán)禁采用3'突出的限制性?xún)?nèi)切酶（如實(shí)在只能用3'突出的限制性?xún)?nèi)切酶，則可在酶切后用T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段在4種dNTP存在下消除3'突出端）。轉(zhuǎn)錄模板中應(yīng)沒(méi)有同樣的酶切位點(diǎn)。載體上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)?？捎玫南拗菩?xún)?nèi)切酶只有NcoI、SpeI、NdeI。酶切后，電泳檢測(cè)，如果酶切結(jié)果正常，就可以大量酶切模板。一般選用100－150l酶切體系。4.轉(zhuǎn)錄模板的純化將四管酶切產(chǎn)物合并一起（1.5ml離心管），（從此時(shí)起一直到雜交結(jié)束，要進(jìn)行嚴(yán)格的RNA操作）用DEPC?H2O將總體積補(bǔ)到為600-700l。①加入等體積的苯酚，漩渦振蕩器充分震蕩混勻，12000rpm離心5min。取水相；②再加入等體積氯仿（RNA用），漩渦振蕩器充分震蕩混勻，12000rpm離心5min，取水相；（在此實(shí)驗(yàn)操作中，氯仿的主要作用是抽提苯酚）重復(fù)1次氯仿抽提。將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。（注意：小心取上部水相，體積約占水相總體積的2/3即可，勿貪下部水相可能含有痕量的苯酚——RNA聚合酶的強(qiáng)烈抑制劑，它的存在將嚴(yán)重降低轉(zhuǎn)錄效率甚至導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失敗。實(shí)驗(yàn)表明，氯仿抽提時(shí)充分震蕩混勻和最后的吸取水相的操作是探針合成中最關(guān)鍵的步驟）③加入1/10體積的NaAC(3M，PH5.2)①,混勻后，再加入2.0倍體積冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)以上以沉淀模板。④12,000rpm離心10分鐘。加入1ml預(yù)冷的70%乙醇，用移液器輕輕將沉淀整塊打起，12,000rpm離心2分鐘，用移液器輕輕吸走乙醇,再加入預(yù)冷的200l無(wú)水乙醇，13,000rpm離心2分鐘。⑤用真空泵將管壁上的液體吸干（千萬(wàn)不要將沉淀洗走），在37℃烘箱烘干5min，用適當(dāng)體積的滅菌ddH2O（容器應(yīng)為180℃烘烤過(guò)）重懸（根據(jù)沉淀大小而定，通常為20l），⑥取1l上述模板溶液進(jìn)行電泳檢測(cè)，用探針合成試劑盒的vial3或vial41l作為對(duì)照（濃度為250ng/l）或DNAmarker，粗略估計(jì)模板的濃度(至少為1g/13l)。5.轉(zhuǎn)錄(20l反應(yīng)體系,用1.5ml離心管。加樣操作在室溫下進(jìn)行)1）取1-2g模板，用滅菌ddH2O補(bǔ)到13l。2）按照次序加下列試劑：（用10l的長(zhǎng)槍頭，一定要將槍頭插緊。要避免污染試劑的瓶蓋）10×NTPlabelingmixture2l（室溫融化，充分混勻后再吸取）10×Transcriptionbuffer2l（室溫融化，充分混勻后再吸?。㏑Naseinhibitor1l（室溫放置，加樣后及時(shí)放回冰箱）RNAPolymeraseSP6orRNAPolymeraseT72l（RNAPolymerase在加樣前應(yīng)短暫離心，冰浴放置，加樣后馬上放回冰箱。）加完后槍打混勻，稍離心。37℃溫育2小時(shí)。3）（事先準(zhǔn)備好：電泳槽、梳子及灌膠的模子均需用乙醇清洗、晾干，化膠時(shí)最好用RNA專(zhuān)用的三角瓶，1％的DNA－TAE膠。）。取0.5l轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，電泳檢測(cè)探針的長(zhǎng)度,粗略估計(jì)產(chǎn)量和長(zhǎng)度（100v15min－20min。一般情況下，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)至此為2.5小時(shí)。可再加1lRNAPolymerase繼續(xù)反應(yīng)1h,以增加產(chǎn)量）4）加2lDNaseⅠ(RNase-free)37℃溫育15-30分鐘去除模板DNA。5）加2l0.2MEDTA(pH8.0)，敲打混勻，中止反應(yīng)。6.沉淀、收集探針：中止反應(yīng)后依次加入以下試劑1l10mg/mltRNA（如后面要進(jìn)行溫和堿性水解，則不能加tRNA）2.5l4MLiCI敲打混勻75l冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，槍打混勻，-20℃2小時(shí)以上或過(guò)夜。注意：因槍頭相對(duì)較熱，吸取冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇時(shí)，應(yīng)反復(fù)吸打幾次，直至打出時(shí)無(wú)氣泡產(chǎn)生，再吸取。如此，則體積準(zhǔn)確。4℃13000rpm離心15分鐘得沉淀，用冰預(yù)冷的70%乙醇洗2次，每次100-200l，4℃13000rpm離心5分鐘。37℃空氣干燥5分鐘，重懸于50lDEPC·H2O中，-70℃保存。（為使探針徹底溶解，可在55℃溫浴5-10分鐘。迅速冰浴5分鐘，稍離心，-70℃保存。）7．溫和堿性水解，以調(diào)整探針長(zhǎng)度（可選，小于500bp可不進(jìn)行水解）：堿解：方案①取50l探針溶液，依次加入20l0.2MNaHCO330l0.2mMNa2CO3方案②取50l探針溶液，加入50l蘇打水溶液（20l0.2MNaHCO3和30l0.2MNa2CO3。）②60℃水解T分鐘：水解時(shí)間Tmin=（L0-Lf）/(0.11×L0×Lf),其中L0、Lf分別為探針初始長(zhǎng)度和最終長(zhǎng)度，單位為kb，合適的最終長(zhǎng)度是150bp。沉淀：用10l1MNaAC（PH4.7）緩沖液終止反應(yīng)。加入：1l20mg/ml的糖原、10l4M的LiCI，300l冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，槍打混勻，-20℃2小時(shí)以上。收集探針：4℃13000rpm離心10-15分鐘得沉淀，用冰預(yù)冷的70%乙醇洗2次，每次500l，4℃13000rpm離心10分鐘。37℃空氣干燥5分鐘，重懸于50lDEPC·H2O中。8.探針半定量：參見(jiàn)《原位探針半定量》步驟附錄：①3MNaAC(PH5.2)：50mlNaAC·3H2O20.41g（MW:136.08）ddH2O25ml冰醋酸5mlddH2O定容，DEPC處理，高壓滅菌，室溫保存。②0.2MNaHCO3（10ml）：NaHCO30.168g0.2MNa2CO3（10ml）：Na2CO30.212g分別用DEP