引起感染性腹瀉的主要病原體及常見(jiàn)感染性腹瀉的主要特征、實(shí)驗(yàn)室診斷方法、感染性腹瀉的鑒別診斷

（資料性）引起感染性腹瀉的主要病原體及常見(jiàn)感染性腹瀉的主要特征引起感染性腹瀉的主要病原體種類(lèi)引起感染性腹瀉的主要病原體種類(lèi)見(jiàn)表A.1。引起感染性腹瀉的主要病原體種類(lèi)種類(lèi)主要病原體細(xì)菌非傷寒沙門(mén)菌致瀉性大腸埃希菌：腸致病性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸出血性大腸埃希菌/產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌、腸集聚性大腸埃希菌等致瀉性弧菌：副溶血弧菌、不產(chǎn)霍亂腸毒素的霍亂弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、擬態(tài)弧菌、霍利斯弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌等彎曲菌：空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌等耶爾森菌：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等其它細(xì)菌：?jiǎn)伟?、厭氧芽胞桿菌等病毒輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒、腸腺病毒等寄生蟲(chóng)隱孢子蟲(chóng)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)等其它真菌等常見(jiàn)感染性腹瀉的主要特征非傷寒沙門(mén)菌感染本標(biāo)準(zhǔn)中非傷寒沙門(mén)菌感染指除傷寒及甲、乙、丙型副傷寒以外的其它沙門(mén)菌引起的以腹瀉為主的腸道內(nèi)感染。沙門(mén)菌為革蘭陰性短小桿菌，無(wú)莢膜，有動(dòng)力，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜。在水、牛乳或肉類(lèi)食品中能存活一年以上，加熱60℃30min可滅活，對(duì)含0.3mg/L～0.5mg/L余氯的氯化消毒飲用水及酚、陽(yáng)光等敏感。非傷寒沙門(mén)菌感染為重要人獸共患病之一，傳染源為病例、帶菌者、患病及帶菌動(dòng)物。以食源性和醫(yī)源性傳播為主，也可通過(guò)水源及接觸傳播。人群普遍易感，幼兒（尤其1歲以?xún)?nèi)）更敏感。全年均可發(fā)病，夏秋季多發(fā)。潛伏期多為6h～24h，急性起病，伴惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱或不發(fā)熱。嬰幼兒較易發(fā)生脫水和電解質(zhì)紊亂。免疫力低下或免疫抑制人群（如嬰幼兒、老人、艾滋病患者、腫瘤患者等）易發(fā)生侵襲性沙門(mén)菌感染(如菌血癥、敗血癥等)。糞便多為黃色或綠色稀水便，亦可帶有黏液和鮮血，部分病例糞便鏡檢可見(jiàn)較多的白細(xì)胞及紅細(xì)胞，并可見(jiàn)巨噬細(xì)胞。致瀉性大腸埃希菌感染大腸埃希菌是革蘭陰性桿菌，無(wú)芽胞，多有鞭毛。主要抗原為菌體（O）和鞭毛（H）抗原。引起感染性腹瀉的主要有5個(gè)致病型：——腸致病性大腸埃希菌（EPEC）；——腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）；——腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）；——腸出血性大腸埃希菌/產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(EHEC/STEC)；——腸集聚性大腸埃希菌（EAEC）。該菌對(duì)熱的抵抗力較其它腸道桿菌強(qiáng)，55℃60min或60℃15min仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。典型的腸致病性大腸埃希菌（EPEC）傳染源主要是病例及帶菌者，而非典型EPEC除人外，動(dòng)物為重要宿主。EPEC以糞-口途徑為主要傳播方式，以嬰幼兒多見(jiàn)；5月、6月為發(fā)病高峰。輕癥者不發(fā)熱，大便每日3～10余次呈黃色蛋花樣便，量較多；重癥病例可有發(fā)熱、嘔吐、腹痛、腹脹，呈黏液便，嘔吐、腹瀉嚴(yán)重者可有失水、酸中毒表現(xiàn)。成人常急性起病，臍周腹痛伴痢疾樣大便。糞便鏡檢可見(jiàn)少許紅、白細(xì)胞，偶可滿視野，并有大量脂肪顆粒。腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）病例和帶菌者為主要傳染源，主要通過(guò)被污染的水體、食品、牛奶、飲料等傳播，可散發(fā)或暴發(fā)流行，多表現(xiàn)為“旅游者腹瀉”或食物中毒。人群對(duì)ETEC普遍易感，成人、小兒均可發(fā)病。潛伏期一般為0.5d～7d。癥狀表現(xiàn)為分泌性腹瀉，水樣便，伴有腹部痙攣、惡心、嘔吐、頭痛、肌痛，很少發(fā)熱。病情輕重不等，有的僅有輕微腹瀉，有的呈重癥霍亂樣，重度脫水，酸中毒，甚至死亡。鏡檢可有少量或無(wú)紅細(xì)胞、白細(xì)胞。腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）可通過(guò)污染的水和食物引起暴發(fā)或流行，也可因接觸傳播形成散發(fā)病例；成人、兒童均可發(fā)病。臨床表現(xiàn)與菌痢相似，表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、里急后重、膿血便。糞便鏡檢可有紅細(xì)胞、白細(xì)胞。腸出血性大腸埃希菌/產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(EHEC/STEC)中，O157:H7是重要的血清型。牛羊等反芻動(dòng)物為EHEC/STEC貯存宿主和主要傳染源，病例和帶菌者也是傳染源之一；經(jīng)消化道以及接觸傳播；人群普遍易感，但以老人、兒童為主；季節(jié)性明顯，7月～9月為流行高峰。主要臨床表現(xiàn)為突發(fā)腹部痙攣性疼痛、不適，初為水樣便，繼之轉(zhuǎn)為鮮血性糞便、不發(fā)熱或低熱，可伴惡心、嘔吐。大便鏡檢幾無(wú)炎癥滲出性細(xì)胞。多數(shù)病例表現(xiàn)為自限性疾病；少數(shù)病例可出現(xiàn)急性溶血性尿毒綜合征（HUS）以及血小板減少性紫癜（TPP）。HUS和TPP通常出現(xiàn)在腹瀉發(fā)生后5d-10d，病死率一般在10%左右，應(yīng)早期識(shí)別和處理。血性便病例鏡檢可見(jiàn)大量紅細(xì)胞。腸集聚性大腸埃希菌（EAEC）主要傳染源是人，主要與小兒頑固性腹瀉有關(guān)，癥狀可持續(xù)兩周或以上，也是HIV感染者腹瀉的常見(jiàn)病原菌，其典型癥狀包括水樣便、黏液樣便、分泌性腹瀉，通常無(wú)嘔吐或很少出現(xiàn)嘔吐，不伴有發(fā)熱或僅有低熱。部分病例糞便鏡檢可見(jiàn)紅細(xì)胞。致瀉性弧菌感染致瀉性弧菌革蘭染色陰性，多呈短桿狀或彎曲樣，無(wú)芽胞，有鞭毛。需氧或兼性厭氧，多有嗜鹽性，耐堿畏酸，對(duì)熱敏感。氧化酶陽(yáng)性，粘絲試驗(yàn)陽(yáng)性（副溶血弧菌除外），基因組為雙染色體。廣泛分布于溫帶和熱帶海洋、海口和近海岸水體中，水溫升至18℃以上可大量繁殖。引起人類(lèi)弧菌性胃腸炎，主要通過(guò)污染的食物、水等傳播，可常年發(fā)病，夏秋季為發(fā)病高峰，沿海地區(qū)發(fā)病較高。各年齡均易感，兒童和青壯年居多，病例大多有生食海鮮、接觸海水或進(jìn)食被污染食物的飲食史。臨床潛伏期長(zhǎng)短不一，短至幾小時(shí)或長(zhǎng)至數(shù)天，病例有惡心、嘔吐、腹痛及腹瀉等臨床癥狀，可有或無(wú)發(fā)熱，重癥可脫水，循環(huán)衰竭，少數(shù)有中毒性休克。糞便可呈水樣便、血便或膿血便，鏡檢可見(jiàn)白細(xì)胞和膿細(xì)胞，常伴有紅細(xì)胞，亦可見(jiàn)巨噬細(xì)胞。常見(jiàn)的引起人類(lèi)弧菌性胃腸炎的致瀉性弧菌包括副溶血弧菌、不產(chǎn)霍亂腸毒素的霍亂弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、霍利斯弧菌、溶藻弧菌等，其中副溶血弧菌腸炎、不產(chǎn)霍亂腸毒素的霍亂弧菌、河弧菌和溶藻弧菌導(dǎo)致的胃腸炎較為常見(jiàn)。彎曲菌感染彎曲菌為微需氧菌，革蘭染色陰性，多形態(tài)性，無(wú)芽胞，引起人類(lèi)腹瀉的主要是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。該菌抵抗力不強(qiáng)，對(duì)熱敏感，60℃5min即可滅活，對(duì)物理和化學(xué)消毒劑均敏感。彎曲菌感染引起的疾病稱(chēng)為彎曲菌病，為人獸共患病，主要傳染源是家禽、家畜和鳥(niǎo)類(lèi)，急性期病例和帶菌者可為傳染源。主要經(jīng)食物和水傳播，也可接觸傳播。人群普遍易感。全年均可發(fā)病，有冬春季節(jié)的發(fā)病高峰。平均潛伏期3d～5d，主要癥狀為發(fā)熱、腹瀉、腹痛，少數(shù)伴有嘔吐；糞便呈黃色水樣便，部分為黏液便和膿血便。典型者臍周呈痙攣性絞痛。糞便鏡檢可見(jiàn)白細(xì)胞或多量紅細(xì)胞及膿細(xì)胞。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染造成的疾病稱(chēng)為“耶爾森菌病”，是一種食源性疾病，也是一種人獸共患病。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌為革蘭陰性、無(wú)芽胞短小桿菌，在0℃～45℃都可生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)溫度為25℃～28℃，具有嗜冷性，在冰箱等低溫環(huán)境下能夠長(zhǎng)期存活。對(duì)濕熱和化學(xué)消毒劑敏感。耶爾森菌病主要傳染來(lái)源為被小腸結(jié)腸炎耶爾森菌污染的食物和帶菌動(dòng)物，主要通過(guò)糞-口途徑傳播。部分膿毒癥病例是由于輸入了耶爾森菌無(wú)癥狀帶菌者的血液而受到血源性感染。人群普遍易感，報(bào)告的病例以嬰幼兒居多。全年均可發(fā)病，以冬、春季發(fā)病較多。該病潛伏期1d～10d，主要表現(xiàn)急性胃腸炎，部分伴有發(fā)熱、腹痛，部分病例表現(xiàn)為右下腹痛的末端回腸炎，應(yīng)與闌尾炎鑒別。糞便呈稀便、水樣便或黏液便，偶爾可見(jiàn)帶血，鏡檢可見(jiàn)白細(xì)胞、紅細(xì)胞。部分病例在發(fā)生腹瀉開(kāi)始后的幾天到幾個(gè)月，可出現(xiàn)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、突眼性甲狀腺腫、耶爾森菌肝炎、心內(nèi)膜炎、腎炎等多種自身免疫性腸外并發(fā)癥，并持續(xù)數(shù)月。嚴(yán)重感染可發(fā)生膿毒癥，病死率在40%以上。病例臨床表現(xiàn)不盡相同：急性胃腸炎多見(jiàn)于嬰幼兒，末端回腸炎多見(jiàn)于青少年；人類(lèi)白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）等位基因攜帶者、免疫抑制病例感染后更易發(fā)生自身免疫性腸外并發(fā)癥；鐵過(guò)載的病例感染后更易發(fā)生全身性感染。輪狀病毒感染人輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，基因組為11個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA，病毒直徑約為70nm～75nm，呈球形，具有外層衣殼、中間層衣殼和內(nèi)層衣殼的三層結(jié)構(gòu)。由于外層衣殼表面有60個(gè)長(zhǎng)度為12nm的穗狀物突起，電鏡下完整病毒顆粒如車(chē)輪狀。根據(jù)構(gòu)成中間層衣殼的組特異性抗原（VP6），目前將RV分為九個(gè)組（A-D、F-J）。A、B、C、H組可以感染人類(lèi)，其中A組輪狀病毒的感染最常見(jiàn)，占所有輪狀病毒感染的90%。在同一組內(nèi)，根據(jù)兩個(gè)外殼蛋白VP7和VP4的不同，將輪狀病毒分為不同的G和P基因型。目前A組輪狀病毒全球主要流行株為G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]及G9P[8]，近幾年，我國(guó)輪狀病毒的流行株為G9P[8]，同時(shí)G8P[8]呈快速增加。輪狀病毒在外環(huán)境中較穩(wěn)定，室溫下可存活數(shù)月，耐酸、耐堿，55℃30min可使其滅活。本病傳染源為病例和隱性感染者，傳染期為癥狀開(kāi)始前，以及癥狀消失后3d內(nèi)；主要經(jīng)糞-口途徑傳播，密切接觸也可傳播，存在經(jīng)呼吸道氣溶膠傳播的可能；A組主要感染5歲以下兒童尤以2歲以下兒童為甚，是兒童重癥脫水性腹瀉的最主要病原，全年散發(fā)，秋冬季為高發(fā)季節(jié)；潛伏期2d～3d，主要癥狀為腹瀉和嘔吐，可伴發(fā)熱和/或呼吸道癥狀，一般癥狀持續(xù)4d～8d，嚴(yán)重者常伴有脫水及代謝性中毒，可有腸道外表現(xiàn)，如呼吸道感染、驚厥、心肌炎、腦炎等；大便為水樣便或黃色稀便，無(wú)黏液、無(wú)膿血。B組主要感染成人，我國(guó)在20世紀(jì)80年代曾引起一次大規(guī)模暴發(fā)，目前鮮有病例；潛伏期2d～3d，以腹瀉為主，伴惡心、嘔吐、腹痛、乏力等癥狀。大便多為黃色水樣便，無(wú)黏液及膿血。鏡檢多無(wú)異常，少數(shù)可見(jiàn)少量白細(xì)胞。C組輪狀病毒主要感染兒童，以散發(fā)病例為主，感染率低。H組輪狀病毒主要感染成人，在我國(guó)曾引起暴發(fā)，目前未有病例報(bào)道。諾如病毒感染諾如病毒屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，無(wú)包膜，直徑27nm～40nm，電鏡下呈圓球狀或多面狀，有很強(qiáng)的耐乙醚、耐酸及耐熱能力。諾如病毒傳染源為諾如病毒胃腸炎患者，病人在潛伏期即可排出諾如病毒，排毒高峰在發(fā)病后2d～5d，持續(xù)約2周～3周；隱性感染者在傳播中的作用未知。傳播途徑為糞-口途徑，方式多樣，包括接觸感染者或感染者的糞便和嘔吐物、間接接觸被糞便或嘔吐物污染的物品和環(huán)境、攝入被污染的食物或水以及嘔吐物產(chǎn)出的氣溶膠等。諾如病毒全人群均易感。全年散發(fā)，暴發(fā)流行季節(jié)一般在冬春季。潛伏期12h～48h，癥狀主要以腹瀉和（或）嘔吐為主，可伴有腹痛、惡心、發(fā)熱、頭痛、肌痛、乏力、及食欲減退等，癥狀一般在12h～72h自愈。大便多為黃色水樣便，無(wú)黏液及膿血。鏡檢多無(wú)異常，少數(shù)可見(jiàn)少量白細(xì)胞。腸腺病毒感染腺病毒為無(wú)包膜的雙股DNA病毒，至少分為67個(gè)血清型，其中40型和41型即腸腺病毒。病毒顆粒呈球形，直徑70nm～90nm，病毒體呈類(lèi)似通訊衛(wèi)星樣結(jié)構(gòu)。腺病毒對(duì)酸堿及溫度的耐受范圍較寬，對(duì)脂溶劑有較強(qiáng)的抵抗力，紫外線照射30min或56℃30min可被滅活。傳染源為病例和隱性感染者，可經(jīng)接觸、糞-口途徑和呼吸道傳播，嬰幼兒多發(fā)，無(wú)明顯季節(jié)性，以散發(fā)和地方性流行為主。潛伏期3d～10d。臨床癥狀以腹瀉為主，可伴嘔吐、發(fā)熱，亦可有呼吸道感染癥狀。糞便呈水樣便或稀水便，少數(shù)可有黏液；鏡檢無(wú)膿細(xì)胞及紅細(xì)胞，可有少量白細(xì)胞。隱孢子蟲(chóng)感染隱孢子蟲(chóng)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)致病寄生原蟲(chóng)，隸屬于孢子蟲(chóng)綱，球蟲(chóng)目，其生活史包括卵囊、子孢子、滋養(yǎng)體、裂殖體、雌雄配子體及合子等階段，僅需單一宿主即可完成，完成整個(gè)生活史約13d～15d；目前已發(fā)現(xiàn)的38種隱孢子蟲(chóng)中，感染人的主要是微小隱孢子蟲(chóng)和人隱孢子蟲(chóng)；感染隱孢子蟲(chóng)的人和動(dòng)物以及無(wú)癥狀帶蟲(chóng)者為傳播本病的主要傳染源；感染階段為卵囊，人經(jīng)口食入隱孢子蟲(chóng)卵囊獲得感染，卵囊對(duì)多種常用消毒劑和化學(xué)品有較強(qiáng)的抵抗力，在濕冷的環(huán)境下可存活數(shù)月或1年左右；傳播方式以糞-口為主；全年均可發(fā)病，但溫暖、潮濕夏秋季節(jié)多見(jiàn)；本病潛伏期為2d～28d，多數(shù)為7d～10d；急性期臨床癥狀的嚴(yán)重程度與病程取決于宿主的免疫狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)狀況。免疫功能正?；颊叩陌Y狀較輕，主要為急性自限性腹瀉，一般無(wú)膿血，每日排便2次～20余次；病程多持續(xù)7d～14d，最短1d～2d；免疫缺陷患者，腹瀉程度嚴(yán)重，常表現(xiàn)為霍亂樣水瀉。嚴(yán)重感染的幼兒可出現(xiàn)噴射性水樣便，量多，常伴有痙攣性腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、食欲減退或厭食、口渴和發(fā)熱。慢性期患者病程多為20d～60d，長(zhǎng)者數(shù)年。免疫功能異常的感染者癥狀明顯且病情重，持續(xù)性霍亂樣水瀉最為常見(jiàn)，每日腹瀉數(shù)次至數(shù)十次，每日水瀉便量常見(jiàn)為3L～6L，最多可達(dá)17L，導(dǎo)致水、電解質(zhì)紊亂和酸中毒。免疫功能缺損者尤其是HIV/AIDS患者，隱孢子蟲(chóng)感染后可導(dǎo)致廣泛播散，并發(fā)膽道、胰管或呼吸道等腸外器官隱孢子蟲(chóng)病，表現(xiàn)為膽囊炎、膽管炎、胰腺炎和肺炎；當(dāng)癥狀消失后數(shù)周內(nèi)仍有卵囊隨糞便排出。兒童營(yíng)養(yǎng)不良以及某些病毒性感染，如麻疹、水痘和巨細(xì)胞病毒感染，也會(huì)因暫時(shí)的免疫功能異常而并發(fā)隱孢子蟲(chóng)病，引起嚴(yán)重慢性腹瀉。隱孢子蟲(chóng)感染并發(fā)癥包括水電解質(zhì)紊亂，其它病原體混合感染，部分有腹部痙攣性疼痛、惡心、嘔吐、厭食、發(fā)熱和全身不適等。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)感染藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)（簡(jiǎn)稱(chēng)賈第蟲(chóng)）為單細(xì)胞原蟲(chóng)，歸屬雙滴蟲(chóng)目，六鞭毛科，賈第鞭毛蟲(chóng)屬。其生活史分滋養(yǎng)體（營(yíng)養(yǎng)繁殖階段）和包囊（傳播階段）兩個(gè)時(shí)期，滋養(yǎng)體主要寄生于人和動(dòng)物的十二指腸或上段小腸，偶爾寄生于膽道或胰管，包囊在外界存活能力強(qiáng)，在水中或涼爽的環(huán)境中可存活2個(gè)月之久；傳染源為排出包囊的人和動(dòng)物，主要通過(guò)糞-口途徑傳播，包括水源性傳播、食物傳播、人與人間密切接觸傳播和性接觸傳播等方式；全年均可發(fā)病，夏秋季高發(fā)，我國(guó)各地均有發(fā)生，但以南方多見(jiàn)，感染以小兒為多見(jiàn)；本病潛伏期1周～2周，最長(zhǎng)45d；臨床表現(xiàn)多為自限性腹瀉、無(wú)癥狀帶蟲(chóng)、慢性腹瀉以及相關(guān)的吸收障礙和體重減輕等；兒童嚴(yán)重感染且未經(jīng)及時(shí)治療，腹瀉病程較長(zhǎng)，常出現(xiàn)消瘦、貧血、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、肝脾大和營(yíng)養(yǎng)吸收障礙等；艾滋病病例及其他免疫功能低下的病例合并賈第蟲(chóng)感染，臨床表現(xiàn)常較嚴(yán)重，對(duì)藥物治療反應(yīng)不佳，病例難以康復(fù)，病死率高，會(huì)發(fā)生多種并發(fā)癥且較易向其他臟器擴(kuò)展；偶爾可異位寄生于膽道發(fā)生膽囊炎、膽管炎或累及肝臟腫大，闌尾炎等。（規(guī)范性）實(shí)驗(yàn)室診斷方法沙門(mén)菌檢驗(yàn)標(biāo)本收集采集腹瀉病例急性期、宜在抗生素應(yīng)用以前的新鮮糞便2g～5g或2mL～5mL，置于干凈廣口容器內(nèi)，糞便挑取有膿血、黏液部分，盡快檢驗(yàn)。運(yùn)送時(shí)間超過(guò)2h者，標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中，在4℃冷藏條件下48h內(nèi)送檢，超過(guò)48h未送檢的糞便，宜在-80℃30%甘油肉湯凍存；或?qū)⒓S便標(biāo)本直接接種增菌培養(yǎng)基，室溫條件下運(yùn)送。如不易獲得糞便，或排便困難的病例及幼兒，可采用直腸拭子法采便：將棉拭子前端用30%無(wú)菌甘油或等滲鹽水（0.9%氯化鈉）浸潤(rùn)（棉拭子多余的液體貼管壁擠出），然后插入肛門(mén)4cm～5cm（幼兒約2cm～3cm）處，輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)，于緊靠肛環(huán)邊的隱窩處采集直腸表面黏液后取出，拭子放入可旋蓋密封的離心管或含Cary-Blair培養(yǎng)基的離心管中，旋緊蓋子以防水分丟失和漏灑。肛拭子運(yùn)送條件同新鮮糞便。分離培養(yǎng)直接分離培養(yǎng)腹瀉糞便中沙門(mén)菌直接分離培養(yǎng)陽(yáng)性率低于增菌培養(yǎng)，常規(guī)不推薦糞便直接分離培養(yǎng)沙門(mén)菌。取新鮮糞便、嘔吐物標(biāo)本直接接種于中等強(qiáng)度選擇性培養(yǎng)基(科瑪嘉沙門(mén)顯色培養(yǎng)基、木糖賴(lài)氨酸去氧膽酸鈉瓊脂（XLD）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、Hektoen腸道菌（HE）瓊脂等)和弱選擇性培養(yǎng)基（麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂）平板各一塊，35℃～37℃培養(yǎng)18h～24h，從平板上挑取可疑菌落（見(jiàn)表B.1）進(jìn)行鑒定。沙門(mén)菌屬在選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板菌落特征科瑪嘉沙門(mén)顯色培養(yǎng)基多數(shù)沙門(mén)菌為紫色或淡紫色菌落，但亞利桑那沙門(mén)菌為藍(lán)色菌落；菌落圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)木糖賴(lài)氨酸去氧膽酸鈉瓊脂（XLD）多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色，菌落周?chē)该?；不產(chǎn)硫化氫菌株為無(wú)色透明菌落；菌落均為圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)亞硫酸鉍瓊脂（BS）還原亞硫酸鉍菌落為黑色或墨綠色，菌落周?chē)囵B(yǎng)基可呈黑色有金屬光澤；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周?chē)囵B(yǎng)基不變；菌落圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)Hektoen腸道菌（HE）藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色；菌落圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)麥康凱瓊脂（Mac）無(wú)色半透明；菌落圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）無(wú)色半透明；菌落圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)增菌培養(yǎng)取新鮮糞便、嘔吐物0.5g～1g或1mL接種于10mL亞硒酸鹽煌綠增菌液（SBG）或四硫酸鈉煌綠增菌液（TTB）或亞硒酸鹽半胱氨酸增菌液（SC）中；35℃～37℃增菌6h～8h，挑取1～2接種環(huán)增菌液分別轉(zhuǎn)種至強(qiáng)選擇性和弱選擇性培養(yǎng)基平板各一塊，35℃～37℃培養(yǎng)18h～24h，從平板上挑取可疑菌落（見(jiàn)表B.1）進(jìn)行鑒定。將肛拭子直接置于10mL亞硒酸鹽煌綠增菌液（SBG）或亞硒酸鹽半胱氨酸增菌液（SC）中；35℃～37℃增菌6h～8h，挑取1～2接種環(huán)增菌液分別轉(zhuǎn)種至強(qiáng)選擇性和弱選擇性培養(yǎng)基平板各一塊，35℃～37℃培養(yǎng)18h～24h，從平板上挑取可疑菌落（見(jiàn)表B.1）進(jìn)行鑒定。鑒定鏡檢沙門(mén)菌革蘭染色顯微鏡下可見(jiàn)革蘭陰性小桿菌，大小（1～3）μm×（0.4～0.9）μm。生化試驗(yàn)挑取可疑菌落接種于三糖鐵（TSI）或雙糖鐵（KIA）和動(dòng)力吲哚尿素（MIU）培養(yǎng)基上，并作氧化酶、硝酸鹽還原、氰化鉀（KCN）抑菌、賴(lài)氨酸脫羧試驗(yàn)；或接種于細(xì)菌生化鑒定板（條）；或利用微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)（儀）進(jìn)行鑒定。凡生化反應(yīng)符合表B.2、表B.3的菌株，隨后利用沙門(mén)菌屬診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)。沙門(mén)菌在TSI或KIA瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果類(lèi)型斜面底層產(chǎn)氣硫化氫A1﹣﹢﹢/﹣﹢A2﹢﹢﹢/﹣﹢A3﹣﹢﹢﹣A4﹣﹢﹣﹣?zhàn)ⅲ憨€表示陽(yáng)性，產(chǎn)酸（黃色）；﹣表示陰性，不產(chǎn)酸（紅色），；﹢/﹣表示多數(shù)陽(yáng)性少數(shù)陰性。沙門(mén)菌生化反應(yīng)結(jié)果類(lèi)型靛基質(zhì)尿素KCN硝酸鹽賴(lài)氨酸硫化氫氧化酶B1﹣﹣﹣﹢﹢﹢﹣B2﹢﹣﹣﹢﹢﹢﹣B3﹣﹣﹣﹢﹢/﹣﹣﹣?zhàn)ⅲ憨€表示陽(yáng)性；﹣表示陰性；﹢/﹣表示多數(shù)陽(yáng)性少數(shù)陰性。血清凝集試驗(yàn)O抗原試驗(yàn)：用A～F或A-S多價(jià)O血清做玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照。對(duì)A～F多價(jià)O血清凝集者，依次用O4；O7；O8；O9；O2和O11等因子血清做凝集試驗(yàn)。生化符合沙門(mén)氏菌屬定義，但A～F或A-S“O”多價(jià)血清不凝集，送具備菌株分型和鑒定資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步鑒定。H抗原試驗(yàn)：先用多價(jià)H血清做凝集試驗(yàn)，如有一種或兩種多價(jià)血清凝集，再用這種多價(jià)血清的各種H單因子血清檢查以確定第1相和第2相的H抗原，必要時(shí)做反相誘導(dǎo)。Vi抗原試驗(yàn)：用Vi因子血清檢測(cè)。分子鑒定利用經(jīng)過(guò)評(píng)價(jià)的特異性及敏感性均較高的引物對(duì)疑似沙門(mén)菌菌落進(jìn)行1個(gè)或多個(gè)沙門(mén)菌特異靶基因或核酸片段的擴(kuò)增，從而快速鑒定沙門(mén)菌屬或其血清型。菌型的判定和結(jié)果報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定結(jié)果，判定血清型并報(bào)告結(jié)果，注意報(bào)告血清型名稱(chēng)的同時(shí)報(bào)送抗原式，無(wú)法確定具體血清型時(shí)則報(bào)告抗原式，對(duì)于邦戈?duì)柹抽T(mén)菌及腸道沙門(mén)菌亞種II、IIIa、IIIb、IV、VI則報(bào)告亞種名稱(chēng)加抗原式，對(duì)于已經(jīng)進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)但暫時(shí)無(wú)法獲得準(zhǔn)確血清型的菌株則報(bào)告未分型。結(jié)果報(bào)告格式示例：a）檢出沙門(mén)菌，鼠傷寒血清型（4,5,12:i:1,2）；b）檢出沙門(mén)菌，鼠傷寒變種（4,5,12:i:-）；c）檢出沙門(mén)菌，4,5,12:-:-；d）檢出沙門(mén)菌，4,5,12:-:1,2；e）檢出沙門(mén)菌，腸道亞種II（58:l,z13,z28:z6）；f）檢出沙門(mén)菌，腸道亞種IIIa（13,23,:g,z51:-）；g）檢出沙門(mén)菌，未分型。核酸檢測(cè)核酸檢測(cè)包括DNA檢測(cè)和RNA檢測(cè)，RNA檢測(cè)更能反映活菌狀態(tài)。一般不宜直接對(duì)糞便原始標(biāo)本進(jìn)行沙門(mén)菌核酸檢測(cè)（全基因組或Meta測(cè)序除外），增菌后利用增菌液或獲得可疑菌落后進(jìn)行核酸檢測(cè)。通常利用經(jīng)過(guò)評(píng)價(jià)的特異性及敏感性均較高的引物進(jìn)行1個(gè)或多個(gè)沙門(mén)菌特異靶基因或核酸片段的擴(kuò)增檢測(cè)。可使用市售的檢測(cè)規(guī)定片段的商品化試劑盒。推薦沙門(mén)菌屬熒光PCR檢測(cè)引物見(jiàn)表B.4。沙門(mén)菌屬核酸檢測(cè)引物序列靶基因名稱(chēng)引物名稱(chēng)引物和探針序列（5’-3’）退火溫度/℃PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpttrstfTTTCGCCACATCACGGTAGC6097strCAGGAGATTACAACATGGCTAAstpFAM-CCAAAAGTGACCATCCCACCGACGGC-BHQ致瀉性大腸埃希菌檢驗(yàn)標(biāo)本收集采集病例急性期、未用抗生素前新鮮糞便、嘔吐物標(biāo)本（1g），盡快送檢。運(yùn)送時(shí)間超過(guò)2h時(shí)，標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中，在冷藏條件下送檢；或?qū)⒓S便標(biāo)本直接接種增菌培養(yǎng)基，室溫條件下運(yùn)送。分離培養(yǎng)直接分離培養(yǎng)取新鮮糞便、嘔吐物標(biāo)本分別接種于麥康凱瓊脂或伊紅美藍(lán)瓊脂等對(duì)大腸埃希菌抑制性較弱的選擇性鑒別培養(yǎng)基或其它商品化的培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h。從平板上挑取可疑菌落（見(jiàn)表B.5）進(jìn)行鑒定。增菌培養(yǎng)對(duì)疑似致瀉性大腸埃希菌感染相關(guān)標(biāo)本，可經(jīng)大腸埃希菌肉湯（EC肉湯）增菌后接種麥康凱等選擇性培養(yǎng)基；如疑似腸出血性大腸埃希菌O157:H7感染標(biāo)本，經(jīng)改良EC肉湯（mEC）增菌液增菌6h，可選用O157免疫磁珠對(duì)增菌液中的目標(biāo)菌進(jìn)行富集，增菌液或經(jīng)免疫磁珠富集后的懸液接種于亞碲酸鉀-頭孢菌素-山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）、O157顯色培養(yǎng)基（如科瑪嘉O157）或山梨醇麥康凱瓊脂。大腸埃希菌的嘔吐物標(biāo)本等先經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯于36℃±1℃增菌培養(yǎng)，待有菌生長(zhǎng)后，挑取1～2接種環(huán)轉(zhuǎn)種至弱選擇性培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)24h。從平板上挑取可疑菌落（詳見(jiàn)表B.5）進(jìn)行鑒定。大腸埃希菌在選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板菌落特征麥康凱（MAC）瓊脂大腸埃希菌發(fā)酵乳糖，在麥康凱瓊脂呈桃紅色不透明菌落；少部分不發(fā)酵乳糖，菌落為無(wú)色伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）瓊脂黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；不發(fā)酵乳糖的菌落為無(wú)色或淺粉色亞碲酸鉀-頭孢菌素-山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）大腸埃希菌O157:H7呈不發(fā)酵山梨醇的無(wú)色灰心菌落，部分菌株發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇為紅色菌落科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基大腸埃希菌O157:H7呈紫紅色或淺紫色菌落致病型鑒定腸致病性大腸埃希菌（EPEC）疑似菌落符合下列特征鑒定為EPEC：標(biāo)本：水樣或蛋花湯樣便、嘔吐物等；革蘭染色鏡檢及生化反應(yīng)符合大腸埃希菌特征；存在特異性緊密粘附素（intimin）基因eae，但不含志賀毒素基因1和2（stx1和stx2）；典型EPEC（typicalEPEC，tEPEC）除含有eae基因外，還攜帶EAF質(zhì)粒編碼的束狀菌毛基因bfp，而非典型EPEC（atypicalEPEC，aEPEC）不含bfp基因（見(jiàn)表B.6）。腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）疑似菌落符合下列特征鑒定為ETEC：a)標(biāo)本：霍亂樣水樣便、嘔吐物等；革蘭染色鏡檢及生化反應(yīng)符合大腸埃希菌特征；存在特異性熱不穩(wěn)定腸毒素（heat-labileenterotoxin）基因lt，豬源熱穩(wěn)定腸毒素（heat-stableenterotoxin）基因stIa或人源熱穩(wěn)定腸毒素基因stIb中的任何一種或以上（見(jiàn)表B.6）。腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）疑似菌落符合下列特征鑒定為EIEC：a)標(biāo)本：細(xì)菌性痢疾樣便、嘔吐物等；革蘭染色鏡檢為革蘭陰性桿菌；生化反應(yīng)：不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)氣，部分菌株無(wú)動(dòng)力，酒石酸鹽陰性，賴(lài)氨酸脫羧酶陰性；存在特異性侵襲性質(zhì)?？乖璈（invasiveplasmidantigenH）基因ipaH（見(jiàn)表B.6）；進(jìn)一步通過(guò)系統(tǒng)生化反應(yīng)同志賀菌屬相鑒別。腸出血性大腸埃希菌（EHEC）/產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（STEC）疑似菌落符合下列特征鑒定為EHEC/STEC：a)標(biāo)本：早期為水樣便，后為血便、嘔吐物等；革蘭染色鏡檢為革蘭陰性桿菌；生化反應(yīng)：不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇，賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖陽(yáng)性，精氨酸、苦杏仁甙陰性；存在特異性志賀毒素1基因（stx1）和/或志賀毒素2基因（stx2），統(tǒng)稱(chēng)為STEC；部分菌株可攜帶eae基因（見(jiàn)表B.6）；血清群為O26、O45、O103、O111、O121、O145及O157，同時(shí)攜帶eae基因的菌株，通常具有更強(qiáng)的致病性，更容易引起出血性腸炎及HUS，通常稱(chēng)為EHEC。腸集聚性大腸埃希菌（EAEC）疑似菌落符合下列特征鑒定為EAEC：a)標(biāo)本：水樣便、黏液便、嘔吐物等；革蘭染色鏡檢及生化反應(yīng)符合大腸埃希菌特征；存在特異性集聚黏附性菌毛調(diào)節(jié)基因aggR；部分非典型EAEC（aggR基因陰性）菌株，可檢測(cè)特異性質(zhì)粒編碼的細(xì)菌外膜透性酶基因aatA和染色體源性的VI型分泌系統(tǒng)蛋白基因aaiC（見(jiàn)表B.6）。致瀉性大腸埃希菌核酸檢測(cè)引物序列致病型靶基因引物序列（5’-3’）產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp退火溫度/℃EPEC/STECeaeF:TCAATGCAGTTCCGTTATCARTT48258R:GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTGtEPECbfpBF:CACCTCATTGCTGAAGTCG90456R:CAGAACACCTCCGTTATGCETECltF:CTCTCTATGTGCAYACGGAGC32558R:TTCCATACTGATTGCCGCAAstIaF:TGTATTATCTTTCCCCTCTTTTAG16055R:ACAACAMARTTCACAGCAGTAAstIbF:GCTCAGGATGCTAAACCAG13856R:ACAACAMARTTCACAGCAGTAAEIECipaHF:TTGACCGCCTTTCCGATAC61258R:GGTCAGCCACCCTCTGAGSTECstx1F:GGATGCAGATAAATCGCCAT37056R:GCAACTCGCGATGCATGATstx2F:CAGTCGTCACTCACTGGTTTCA28360R:GGATATTCTCCCCACTCTGACACstx2fF:TCTCAGGGTGGTRTTTCTGTT98656R:AACAATGGCTGCAAATTCCATEAECaggRF:TAAGACGCCTAAAGGATGCC24957R:CAGAAAAGAAGCTTACAGCCGaatAF:GAATACGAAATTGCAAAGCG76155R:GAAATGTGCTGCAGAAGAAAaaiCF:ATTGTCCTCAGGCATTTCAC21556R:ACGACACCCCTGATAAACAA大腸埃希菌rrsF:CCCCCTGGACGAAGACTGAC40160R:ACCGCTGGCAACAAAGGATA血清分型在通過(guò)特異性基因檢測(cè)確定大腸埃希菌的致病型后，可進(jìn)行O抗原和H抗原分型分析。O:H血清型可以通過(guò)傳統(tǒng)血清凝集法確定，亦可通過(guò)針對(duì)特異性O(shè)抗原基因簇和H抗原基因的PCR方法進(jìn)行確定。致瀉性弧菌檢驗(yàn)標(biāo)本的收集急性期、未用抗生素前采集病例新鮮糞便標(biāo)本或（和）嘔吐物標(biāo)本2g～5g或2mL～5mL，所采集標(biāo)本盡快檢測(cè)。運(yùn)送時(shí)間超過(guò)2h者，標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中；或?qū)⒓S便標(biāo)本直接接種增菌培養(yǎng)基，室溫條件下運(yùn)送。分離培養(yǎng)直接分離培養(yǎng)取新鮮糞便接種于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂或（和）弧菌顯色瓊脂等選擇性培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)18h～24h，從平板上挑取可疑菌落做進(jìn)一步鑒定?；魜y弧菌、副溶血性弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特性見(jiàn)表B.7。增菌培養(yǎng)取新鮮糞便0.5g～1g或0.5mL～1mL接種于pH8.8～9.0的堿性蛋白胨水增菌液，35℃～37℃培養(yǎng)6h～8h，從菌膜下表層取一接種環(huán)培養(yǎng)物，劃線接種于TCBS或（和）弧菌顯色瓊脂平板，35℃～37℃培養(yǎng)18h～24h進(jìn)行分離培養(yǎng)，挑取可疑菌落（見(jiàn)表B.7）做進(jìn)一步鑒定。致瀉性弧菌在選擇性瓊脂平板上的菌落特征致瀉性弧菌TCBS瓊脂菌落特征弧菌顯色瓊脂菌落特征a霍亂弧菌黃色，扁平，直徑2mm～3mm藍(lán)綠色，直徑2mm～3mm副溶血性弧菌綠色或藍(lán)綠色，直徑3mm～5mm紫紅色，直徑2mm～3mm河弧菌黃色，直徑2mm～3mm粉紅或粉白色，直徑2mm～3mm弗尼斯弧菌黃色，直徑2mm～3mm無(wú)色，直徑3mm～5mm溶藻弧菌黃色，直徑3mm～5mm無(wú)色，直徑2mm～3mm擬態(tài)弧菌呈綠色或藍(lán)綠色，直徑2mm～3mm淺藍(lán)綠色，直徑2mm～3mm創(chuàng)傷弧菌綠色或藍(lán)綠色，直徑2mm～3mm藍(lán)綠色，直徑3mm～5mma為科瑪嘉沙門(mén)顯色培養(yǎng)基弧菌顯色培養(yǎng)基上菌落特征。致瀉性弧菌在不同廠家弧菌顯色培養(yǎng)基上的菌落特征有所不同，具體參考相關(guān)產(chǎn)品的廠家說(shuō)明書(shū)。鑒定鏡檢致瀉性弧菌革蘭染色顯微鏡下可見(jiàn)革蘭陰性無(wú)芽胞桿菌，細(xì)菌形態(tài)呈桿狀、弧狀等，常呈多形性。新鮮培養(yǎng)物懸滴法直接鏡檢在暗室野下可見(jiàn)穿梭狀快速運(yùn)動(dòng)。生化試驗(yàn)挑取可疑菌落進(jìn)行生化初篩（KIA/MIU）、氧化酶、粘絲試驗(yàn)，致瀉性弧菌氧化酶陽(yáng)性，粘絲試驗(yàn)陽(yáng)性（副溶血弧菌除外）；或用生化儀或生化條進(jìn)行鑒定。致瀉性弧菌不同種的具體生化特征見(jiàn)表B.8。a)氧化酶試驗(yàn)：用鉑/銥接種環(huán)或牙簽從無(wú)碳水化合物成份的非選擇性瓊脂上挑取可疑菌落的新鮮培養(yǎng)物，涂抹在濾紙上，取2滴～3滴氧化酶試劑（1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺）滴加在菌苔上，20s內(nèi)出現(xiàn)深紫色、紫羅蘭或深藍(lán)色為陽(yáng)性。b)粘絲試驗(yàn)：在玻片或平皿上滴一大滴0.5%去氧膽酸鈉水溶液，從普通瓊脂或其它非選擇性瓊脂上取一接種環(huán)可疑菌落18h～24h培養(yǎng)物，放在溶液旁研磨混勻，再與溶液混合制成濃厚懸液。在1min內(nèi)菌懸液由混變清并變得很黏稠，用接種環(huán)挑取可以拉出細(xì)絲來(lái)者為陽(yáng)性。陰性者呈均勻懸液狀態(tài)，與蒸餾水對(duì)照相同。血清凝集試驗(yàn)?zāi)壳爸聻a性弧菌中只有霍亂弧菌和副溶血弧菌具有商品化的診斷血清，生化符合的副溶血弧菌和霍亂弧菌可用相應(yīng)診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定，同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照。注意TCBS培養(yǎng)基上的疑似菌落常難以乳化，不宜直接進(jìn)行玻片凝集，應(yīng)挑取可疑菌落，先接適宜鹽濃度的普通瓊脂培養(yǎng)基純培養(yǎng)后再作玻片凝集。副溶血弧菌血清凝集試驗(yàn)先準(zhǔn)備較濃厚菌懸液，K抗原檢測(cè)先用不同K混合多價(jià)血清與制備的菌懸液做玻片凝集，陽(yáng)性者再用相應(yīng)的組份單因子K抗血清進(jìn)行凝集檢測(cè)。O抗原檢測(cè)先將菌懸液121℃滅菌處理1h，菌體沉淀離心重懸再與O群血清做玻片凝集?；魜y弧菌直接從普通瓊脂培養(yǎng)基上挑取菌落與O1和O139群特異性霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集，很快出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集顆粒者確定為陽(yáng)性。與O1群血清凝集者，可進(jìn)一步用小川和稻葉型診斷血清分型。不與O1和O139群診斷血清發(fā)生凝集，但生化符合的霍亂弧菌可歸為非O1非O139群霍亂弧菌。分子鑒定可以用經(jīng)過(guò)評(píng)價(jià)的特異性和敏感性較高的種特異性的引物對(duì)可疑菌株進(jìn)行PCR分子鑒定，使用商業(yè)化試劑盒提取菌株DNA或制備菌落水煮模板。注意PCR檢測(cè)每次試驗(yàn)均設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照，推薦的參考引物見(jiàn)表B.9。也可以使用市售的檢測(cè)規(guī)定片段的商品化試劑盒進(jìn)行鑒定。菌型的判定和結(jié)果報(bào)告綜合生化試驗(yàn)、血清學(xué)分型鑒定和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，判定感染菌型并報(bào)告結(jié)果。致病性弧菌鑒定表項(xiàng)目霍亂弧菌擬態(tài)弧菌副溶血弧菌創(chuàng)傷弧菌溶藻弧菌辛辛那提弧菌河弧菌弗尼斯弧菌海魚(yú)弧菌（少女魚(yú)弧菌）霍利斯弧菌麥?zhǔn)匣【钸m生長(zhǎng)溫度/℃373737373725,3537372525,3637氧化酶+＋＋＋＋＋＋＋＋＋－硝酸鹽還原+＋＋＋＋＋＋＋＋＋－靛基質(zhì)+＋＋＋＋－－－－＋／－＋／－ＶＰ+/-－－－＋／－＋－－＋－＋／－尿素酶-－－／＋－－－－－＋－－Ｌ－賴(lài)氨酸+＋＋＋＋＋－－＋／－－－／＋Ｌ－鳥(niǎo)氨酸+＋＋＋／－＋／－－－－－－－Ｌ－精氨酸-－－－－－＋＋＋－＋／－葡萄糖產(chǎn)氣-－－－－－－＋－／＋－－乳糖-/+＋／－－＋－－－－－－＋／－麥芽糖+＋＋＋＋＋＋＋＋－＋Ｄ－甘露醇+＋＋＋／－＋－＋＋－－＋蔗糖+－－－／＋＋＋＋＋－－＋Ｌ－阿拉伯糖-－＋－－＋＋＋－＋－纖維二糖-－－＋－＋－／＋－／＋－－－水楊素-－－＋－＋－－－－－明膠酶+＋＋＋＋－＋＋－－＋／－在不同鹽量肉湯中生長(zhǎng)試驗(yàn)0%NaCl＋＋－－－－－－－－－3%NaCl＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋6%NaCl＋／－＋／－＋＋／－＋＋＋／－＋／－＋＋／－＋8%NaCl－－＋－＋－－／＋＋／－－－＋／－10%NaCl－－－－＋／－－－－－－－O/129弧菌抑制劑10μgSSRSRRRRSRS150μgSSSSSSSSSSSTCBS生長(zhǎng)YGGGYYYYGGY﹢表示陽(yáng)性；﹣表示陰性；﹢/﹣，表示多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性；﹣/﹢，表示多數(shù)陰性，少數(shù)陽(yáng)性；nd，不定；S,敏感；R，耐藥；Y，黃色；G，綠。致瀉性弧菌核酸檢測(cè)推薦引物序列致病菌型靶基因引物序列（5'-3'）產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp退火溫度/℃副溶血弧菌tlhF：AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG45058R：GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC創(chuàng)傷弧菌vvhAF：CCGCGGTACAGGTTGGCGCA51956R：CGCCACCCACTTTCGGGCC河弧菌toxRF：GACCAGGGCTTTGAGGTGGACGAC21765R：AGGATACGGCACTTGAGTAAGACTC溶藻弧菌vppCF：GTGGCTTACACGTTGGAATGATC14256R：TTTGGCAAGGTCTGTTTGGTTAC空腸彎曲菌檢驗(yàn)標(biāo)本收集于急性期、未用抗生素前采集病例新鮮糞便標(biāo)本5g～10g，立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，運(yùn)送時(shí)間超過(guò)2h者，應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，4℃冷藏送檢；糞便量較少（黃豆粒大?。?、便拭子或者肛拭子，可直接將標(biāo)本保存到Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基或者彎曲菌增菌液中，4℃冷藏保存，當(dāng)天運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。保存在增菌液中的標(biāo)本，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)至少在24h內(nèi)，按照增菌培養(yǎng)條件進(jìn)行增菌培養(yǎng)。標(biāo)本的分離培養(yǎng)檢測(cè)培養(yǎng)條件本菌為微需氧菌，在5%O2，10%CO2，85%N2條件下生長(zhǎng)最好。可以使用混合氣體法或者能產(chǎn)生同樣氣體環(huán)境的其它產(chǎn)氣裝置?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌最適宜的培養(yǎng)溫度為42℃。增菌培養(yǎng)可以在微需氧環(huán)境下42℃增菌24h～36h。在平皿上的培養(yǎng)需要在同樣微需氧環(huán)境下42℃培養(yǎng)24h～48h。直接劃線培養(yǎng)采集的病例新鮮糞便標(biāo)本可直接劃線接種于Skirrow血瓊脂平板與Karmali選擇性瓊脂平板，42℃微需氧倒置培養(yǎng)24h～48h。培養(yǎng)24h后如有疑似菌落，則進(jìn)行B.1.3鑒定，如培養(yǎng)24h后如細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或者菌落很小，可增加培養(yǎng)時(shí)間至48h，72h后仍無(wú)疑似菌落判斷為陰性。增菌過(guò)濾培養(yǎng)從便盒中，挑取黃豆粒大小人糞標(biāo)本（或者取300μL～500μL水樣便），加入到2mL的彎曲菌Preston增菌液中，充分混勻。將便拭子或者肛拭子放入2mL的Preston的彎曲菌增菌液中，充分?jǐn)D壓混勻，取出棉簽。將加入標(biāo)本的增菌液在微需氧環(huán)境下，42℃增菌培養(yǎng)24h。使用0.45μm濾膜，將其輕輕貼在哥倫比亞血瓊脂平板和Karmali瓊脂平板中央表面，取出增菌培養(yǎng)物，擰緊培養(yǎng)管的管口后輕輕混勻，擰開(kāi)關(guān)口，取300μL～500μL的增菌培養(yǎng)物，分成4點(diǎn)～6點(diǎn)，呈梅花樣滴加于濾膜上，注意滴加的液體不能超過(guò)濾膜的邊緣。在生物安全柜中，等待濾膜上的液體充分透過(guò)濾膜（約45min～60min），迅速揭掉濾膜，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)平板，置于微需氧環(huán)境中42℃或者37℃，培養(yǎng)24h～48h。培養(yǎng)24h后如有疑似菌落，則進(jìn)行菌落鑒定，培養(yǎng)24h后如細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢或者菌落很小，可增加培養(yǎng)時(shí)間至48h，72h后仍無(wú)疑似菌落判斷為陰性。菌落鑒定形態(tài)空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的形態(tài)特征如下：a)疑似菌落：空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌典型菌落形態(tài)一般有兩種，一種呈淺灰或灰白色、半透明而中心顏色較暗，圓形，光滑，中間凸起、針尖狀或小水珠狀，直徑1mm～3mm，邊緣整齊、有光澤的單個(gè)菌落；另一種呈淺灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴狀，形狀常呈不規(guī)則圓盤(pán)狀，直徑2mm～5mm的單個(gè)菌落，培養(yǎng)時(shí)間增加，菌落直徑變大。b)革蘭染色：空、結(jié)腸彎曲菌為革蘭陰性，菌體彎曲如小的半個(gè)括號(hào)狀，或者呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀。生化試驗(yàn)鑒定氧化酶試驗(yàn)挑取至少5個(gè)疑似菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板進(jìn)行分純培養(yǎng)，用接種環(huán)或玻璃棒挑取菌落至氧化酶試劑潤(rùn)濕的濾紙上，如果在10s內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭或深藍(lán)色為陽(yáng)性?？漳c彎曲菌氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)腸彎曲菌氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。馬尿酸鹽水解試驗(yàn)挑取至少5個(gè)疑似菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板進(jìn)行分純培養(yǎng),用接種環(huán)刮取菌苔，接種到0.4mL含1％的馬尿酸鈉溶液中，振搖試管以分散培養(yǎng)物，置37℃培養(yǎng)2h。然后向試管中加入0.2mL茚三酮試劑，將試管于37℃放置10min，出現(xiàn)紫／藍(lán)色者為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)色或灰色為陰性反應(yīng)。以陰性菌和陽(yáng)性菌做對(duì)照?？漳c彎曲菌馬尿酸鹽水解試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)腸彎曲菌馬尿酸鹽水解試驗(yàn)陰性。吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)取50μL含10％吲哚乙酸酯的溶液，將其吸附到直徑為6mm的紙片上，將紙片在空氣中晾干。挑取至少5個(gè)疑似菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板進(jìn)行分純培養(yǎng),挑取分純后的可疑菌落生長(zhǎng)物，將其直接涂布在紙片上，同時(shí)滴加一滴無(wú)菌蒸餾水，觀察5min～10min。紙片顯示藍(lán)綠色為彎曲菌反應(yīng)陽(yáng)性?？漳c彎曲菌吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)腸彎曲菌吲哚乙酸酯水解試驗(yàn)陽(yáng)性。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)挑取至少5個(gè)疑似菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板進(jìn)行分純培養(yǎng),用接種環(huán)挑取菌落，加到干凈玻片上的3%過(guò)氧化氫溶液中，如果在30s內(nèi)出現(xiàn)氣泡則判定結(jié)果為陽(yáng)性?？漳c彎曲菌過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，結(jié)腸彎曲菌過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的生化鑒定特征見(jiàn)表B.10?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌生化試驗(yàn)結(jié)果生化特征空腸彎曲菌結(jié)腸彎曲菌氧化酶++過(guò)氧化氫酶++馬尿酸鹽水解+-吲哚乙酸酯水解++＋表示陽(yáng)性；-表示陰性。核酸檢測(cè)鑒定空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重PCR鑒定參考序列引物名稱(chēng)推薦序列（5'—3’）產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp（鑒定菌種）16S-FATCTAATGGCTTAACCATTAAAC857（空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌）16S-RGGACGGTAACTAGTTTAGTATTmapA-CJFCTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG589（空腸彎曲菌）mapA-CJRGCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTAceuE-CCFATTTGAAAATTGCTCCAACTATG462（結(jié)腸彎曲菌）ceuE-CCRTGATTTTATTATTTGTAGCAGCG空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重PCR鑒定的引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表B.11。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min,4℃保存?？墒褂檬惺鄣木哂型裙πУ牡纳唐坊噭┖羞M(jìn)行鑒定。菌種的判定和結(jié)果報(bào)告根據(jù)B.4.3.1和（或）B.4.3.2，B.4.3.2和（或）B.4.3.3結(jié)果，報(bào)告是否檢出空腸彎曲菌或結(jié)腸彎曲菌。腹瀉病例同時(shí)感染空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的情況很常見(jiàn)。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢驗(yàn)標(biāo)本的采集與運(yùn)送采集腹瀉病人急性期、宜在抗生素應(yīng)用以前的新鮮糞便2g～5g或2mL～5mL，糞便盡量選取有性狀改變部分，置于干凈廣口容器內(nèi)，立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)送時(shí)間超過(guò)2h者，標(biāo)本應(yīng)放入Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中，在4℃冷藏條件下48h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；或?qū)⒓S便標(biāo)本直接接種到耶爾森菌改良PBS增菌培養(yǎng)基內(nèi)，4℃冷藏條件下送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。如不易獲得糞便，可采用直腸拭子法采便：將棉拭子前端用無(wú)菌甘油或等滲鹽水（0.9%氯化鈉）浸潤(rùn)（棉拭子多余的液體貼管壁擠出），然后插入肛門(mén)4cm～5cm（幼兒約2cm～3cm）處，輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)，于緊靠肛環(huán)邊的隱窩處采集直腸表面黏液后取出，拭子放入可旋蓋密封的離心管或含Carry-Blair培養(yǎng)基的離心管中或耶爾森菌改良PBS增菌培養(yǎng)基內(nèi)，旋緊蓋子以防水分丟失和漏灑。肛拭子運(yùn)送條件同新鮮糞便。如果伴有發(fā)熱、且外周血白細(xì)胞高的患者可同時(shí)采集全血進(jìn)行血培養(yǎng)。菌株分離培養(yǎng)方法直接分離培養(yǎng)將糞便標(biāo)本直接接種于耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基（CIN培養(yǎng)基）或麥康凱（MAC）培養(yǎng)基等選擇性瓊脂上，25℃～28℃培養(yǎng)24h～48h。從培養(yǎng)基上挑取可疑菌落（在CIN培養(yǎng)基上為直徑約1mm～2mm，中心呈深玫瑰紅色，周?chē)姓该鳝h(huán)的“公牛眼”狀菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上為圓形、光滑、濕潤(rùn)、扁平略有凸起、半透明的菌落，中央有極淡的粉色的小菌落）接種于尿素培養(yǎng)基。分解尿素者進(jìn)一步進(jìn)行B.5.2.3生化鑒定。血液標(biāo)本直接接種血平板或LB平板，也可接種血培養(yǎng)瓶25℃～28℃培養(yǎng)24h～48h，對(duì)長(zhǎng)出的菌落直接按照B.5.2.3系統(tǒng)生化鑒定。增菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)用標(biāo)本或其它不需要在短時(shí)間內(nèi)獲得培養(yǎng)結(jié)果的樣本，可采用長(zhǎng)時(shí)間冷增菌的策略提高標(biāo)本檢出率。取約1g糞便標(biāo)本接種于10mL改良磷酸鹽緩沖液（改良PBS），于4℃分別增菌培養(yǎng)10d和20d后取增菌培養(yǎng)物接種于CIN、MAC等平板，25℃～28℃培養(yǎng)24h～48h，同按照B.5.2.1方法從平板上挑取可疑菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)。生化鑒定使用質(zhì)量受到公認(rèn)的生化鑒定試劑對(duì)篩選到的可疑菌落是否為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行判斷。目前部分商業(yè)化系統(tǒng)生化鑒定儀對(duì)部分小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株無(wú)法給出準(zhǔn)確鑒定結(jié)果。另外，使用商業(yè)質(zhì)譜鑒定儀判斷為非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株并不能完全否定，仍要最終通過(guò)生化鑒定判斷。本菌主要生化反應(yīng)情況見(jiàn)表B.12，各生化反應(yīng)（除37℃條件下動(dòng)力和VP試驗(yàn)）均在25℃～28℃進(jìn)行。典型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌主要的生化反應(yīng)情況項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果動(dòng)力25℃+葡萄糖產(chǎn)氣-七葉苷V37℃-乳糖V水楊酸VV-P25℃V鳥(niǎo)氨酸脫羧酶+H2S-37℃-精氨酸脫羧酶-吲哚V靛基質(zhì)V賴(lài)氨酸脫羧酶-肌醇V甲基紅+蜜二糖-阿拉伯糖+枸櫞酸鹽-鼠李糖-甘露醇+尿素+蔗糖+纖維二糖+苯丙氨酸脫氨酶-棉子糖-氧化酶-山梨糖+注：+表示陽(yáng)性結(jié)果，-表示陰性結(jié)果；V表示不同菌株結(jié)果不同。血清學(xué)檢測(cè)該菌具有O抗原，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70種以上的血清型。使用分型抗血清或單克隆抗體通過(guò)玻片凝集法進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置鹽水作為對(duì)照。國(guó)際上目前具有商業(yè)化試劑可進(jìn)行檢測(cè)的血清型為O:12、O:3、O:5、O:8、O:9型，我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病病例常見(jiàn)菌株血清型別為O:3與O:9血清型。核酸檢測(cè)使用商業(yè)化試劑盒提取病例標(biāo)本DNA，進(jìn)行小腸結(jié)腸炎耶爾森菌特異性基因foxA、ail的檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表B.13。毒力基因PCR擴(kuò)增引物序列引物引物序列（5'-3'）產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃foxA836GGTTCCTTGAGCGTATTGATG109458foxA1950GGTCATCGGTTTCAGCAGTTTail-FTAATGTGTACGCTGCGAG35157ail-RGACGTCTTACTTGCACTGPCR反應(yīng)體積為20μL，引物使用濃度為10μmol/L，體系內(nèi)上下游引物各加0.5μL；Taq酶：1U/20μl體系。同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min；94℃變性15s，退火30s，72℃延伸30s。共25個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5min。電泳及結(jié)果判斷：PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖上電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察到擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度分別如表中所述則判相應(yīng)基因?yàn)殛?yáng)性。結(jié)果報(bào)告從臨床病例的糞便標(biāo)本中分離到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或檢測(cè)到小腸結(jié)腸炎耶爾森菌特異性基因foxA和（或）ail即可診斷為小腸結(jié)腸耶爾森菌感染。輪狀病毒檢驗(yàn)標(biāo)本收集糞便收集病例早期腹瀉糞便約10g或10mL，置無(wú)菌容器內(nèi)。血液標(biāo)本如做抗體測(cè)定，必須采集2份血清標(biāo)本。第1份(急性期)在發(fā)病時(shí)盡早采集，第2份在發(fā)病后1個(gè)月左右采集。無(wú)菌條件下抽取5mL血液，置于消毒試管。室溫放置2h，待凝固后分離血清。標(biāo)本保存與運(yùn)輸通常對(duì)于短途運(yùn)輸（1d以?xún)?nèi)），包裝盒內(nèi)放冰袋或冰排，長(zhǎng)途運(yùn)輸（1d～2d）要用干冰。標(biāo)本在4℃短期儲(chǔ)存，不能超過(guò)3d。標(biāo)本如果近期不進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)直接在-20℃或-80℃下長(zhǎng)期貯存，并避免反復(fù)凍融。實(shí)驗(yàn)室檢查電鏡檢查：直接電鏡或免疫電鏡檢查病毒顆粒。腹瀉病例糞便上清液0.2mL～0.5mL。直徑約為3mm的銅網(wǎng)，型號(hào)約為44粒徑，銅網(wǎng)覆約50nmFormvar膜及約10nm碳膜，備用。染色液：1%磷鎢酸（pH6.8）。血清為提高電鏡的檢出率，免疫負(fù)染電鏡檢測(cè)前準(zhǔn)備病例恢復(fù)期血清或輪狀病毒免疫動(dòng)物血清：a)病例恢復(fù)期血清(1:5或1:10稀釋)；b)輪狀病毒動(dòng)物免疫血清，其效價(jià)1:64以上，用時(shí)以生理鹽水作1:20～1:50稀釋。直接負(fù)染法取腹瀉病例糞便標(biāo)本約0.2mL～0.5mL，以3000r/min離心5min，取上清5μL～10μL滴加到自鎖鑷子加持的覆膜面向上放置的銅網(wǎng)上，至少1min后用濾紙?jiān)阢~網(wǎng)邊緣吸除標(biāo)本液滴。再將5μL～10μL染液滴加在銅網(wǎng)上，染色1min，用濾紙?jiān)阢~網(wǎng)邊緣吸除染液，室溫干燥后進(jìn)行透射電鏡觀察、檢測(cè)。視野內(nèi)看到輪狀病毒顆粒即可確定。免疫負(fù)染法取經(jīng)3000r/min離心的糞便上清液50μL～100μL，加入病例恢復(fù)期血清或輪狀病毒動(dòng)物免疫血清(稀釋后)50μL～100μL混合，37℃作用1h，4℃過(guò)夜。取上述混合液5～10μL滴加到自鎖鑷子加持的覆膜面向上放置的銅網(wǎng)上，至少1min后用濾紙?jiān)阢~網(wǎng)邊緣吸除標(biāo)本液滴。再將5μL～10μL染液滴加在銅網(wǎng)上，染色1min，用濾紙?jiān)阢~網(wǎng)邊緣吸除染液，室溫干燥后進(jìn)行透射電鏡觀察、檢測(cè)。視野內(nèi)看到輪狀病毒顆粒即可確定。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)將糞便標(biāo)本用PBS稀釋成10%，加SDS（終濃度為1%）于56℃30min處理后，用等量酚、氯仿簡(jiǎn)單抽提病毒RNA，用10%不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳后用硝酸銀染色，可見(jiàn)清晰、典型的11條dsRNA條帶，根據(jù)電泳圖型判定結(jié)果。a）A組輪狀病毒是嬰幼兒腹瀉的主要病原，電泳圖可見(jiàn)11條RNA區(qū)帶分四組，其排列為4.2.3.2。依據(jù)第Ⅳ組10和11RNA片段電泳距離不同，把輪狀病毒分為兩個(gè)亞群：亞群I為短型（S型），兩片段距離短；亞群Ⅱ?yàn)殚L(zhǎng)型（L型），兩片段距離長(zhǎng)。b）B組輪狀病毒即成人腹瀉輪狀病毒，主要引起青壯年腹瀉。11條RNA電泳圖的分布模式為4.2.1.1.1.1.1（或描述為4.2.2.3），第7.8.9節(jié)段明顯分開(kāi)。c）C組輪狀病毒，主要引起嬰幼兒腹瀉，11條RNA電泳圖的分布模式為4.3.2.2，易于與A組和B組輪狀病毒區(qū)別。d）H組輪狀病毒即新型成人腹瀉輪狀病毒。11條RNA電泳圖的分布模式為4.2.1.1.1.1.1，第3.4節(jié)段分開(kāi)，第5.6節(jié)段靠近，第7.8.9節(jié)段明顯分開(kāi)。瓊脂糖凝膠電泳提取的病毒RNA直接用1%瓊脂糖凝膠電泳1h～1.5h，溴化乙錠染色后紫外燈下或凝膠成像系統(tǒng)觀察，依據(jù)電泳圖型判定結(jié)果。電泳圖型的分布模式從上到下為3.2.3.2的規(guī)律。此外，還可以根據(jù)第4組2個(gè)片段遷移率上的差別，把A組輪狀病毒分成長(zhǎng)型和短型，此法比PAGE電泳分析簡(jiǎn)單快速，但檢測(cè)靈敏度較低。免疫學(xué)檢測(cè)膠體金免疫層析試驗(yàn)檢測(cè)糞便中A組輪狀病毒抗原，有商品試劑盒供應(yīng)，試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行。ELISA方法檢測(cè)糞便中A組輪狀病毒抗原，有商品試劑盒供應(yīng)，試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行?？贵w檢測(cè)恢復(fù)期血清與A組輪狀病毒抗原結(jié)合較急性期血清4倍及以上增加。不用于常規(guī)檢測(cè)。B.6.2.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）根據(jù)病毒VP7或VP4基因在不同型的輪狀病毒株間有高度變異而在同型毒株之間這一變異區(qū)高度保守的特征，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄后巢式PCR可區(qū)分輪狀病毒的不同基因型，并可檢測(cè)到不同輪狀病毒的混合感染。根據(jù)檢測(cè)不同基因片段的需要有多種引物序列可以選擇，見(jiàn)表B.14。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按選擇的試劑及擴(kuò)增儀而有所不同。擴(kuò)增產(chǎn)物按常規(guī)進(jìn)行電泳及結(jié)果判斷。用于輪狀病毒核酸檢測(cè)及基因分型的寡核苷酸引物引物名稱(chēng)引物極性分型用途序列（5'-3'）退火溫度/℃片斷大小/bpVP7FG(+)G基因分型第一輪引物ATGTATGGTATTGAATATACCAC42882VP7RG(-)AACTTGCCACCATTTTTTCCaBT1G1(+)G1基因型特異引物CAAGTACTCAAATCAATGATGG618aCT2G2(+)G2基因型特異引物CAATGATATTAACACATTTTCTGTG521G3G3(+)G3基因型特異引物ACGAACTCAACACGAGAGG682aDT4G4(+)G4基因型特異引物CGTTTCTGGTGAGGAGTTG452aAT8G8(+)G8基因型特異引物GTCACACCATTTGTAAATTCG754G9G9(+)G9基因型特異引物CTTGATGTGACTAYAAATAC179VP4FP(+)P基因分型第一輪引物TATGCTCCAGTNAATTGG42664VP4RP(-)ATTGCATTTCTTTCCATAATG2T-1P4(-)P[4]基因型特異引物CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC3623T-1P6(-)P[6]基因型特異引物TGTTGATTAGTTGGATTCAA1461T-1DP8(-)P[8]基因型特異引物TCTACTGGRTTRACNTGC224B.6.2.6病毒分離B.6.2.6.1細(xì)胞系原代非洲綠猴腎或傳代非洲綠猴腎細(xì)胞（MA104）細(xì)胞等。B.6.2.6.2細(xì)胞培養(yǎng)基成分EagLe's培養(yǎng)液、3%谷氨酰胺、青/鏈霉素（10000U/mL、10000μg/mL）、胎牛血清、7.5%碳酸氫鈉、10μg/mL結(jié)晶胰酶。B.6.2.6.3生長(zhǎng)液100mLEagLe’s生長(zhǎng)液中包含EagLe’s液84mL、胎牛血清10mL、青/鏈霉素2mL、3%谷氨酰胺1mL，7.5%碳酸氫鈉調(diào)液體pH至7.2～7.4。B.6.2.6.4維持液100mLEagLe’s維持液中包含EagLe’s液92mL、胎牛血清2mL、青∕鏈霉素2mL、3%谷氨酰胺1mL，7.5%的碳酸氫鈉調(diào)液體的pH至7.2～7.4。B.6.2.6.5實(shí)驗(yàn)步驟取糞便上清液0.2mL～0.5mL先加青/鏈霉素0.2mL4℃過(guò)夜處理或用0.45μm除菌濾器過(guò)濾，將標(biāo)本用終濃度為10μg/mL結(jié)晶胰酶在37℃作用30min，接種到生長(zhǎng)至80%單層細(xì)胞管，37℃吸附1h，棄去標(biāo)本液，換上細(xì)胞維持液（含胰酶0.5μg/mL～1.0μg/mL），在37℃孵育至出現(xiàn)細(xì)胞病變，按照上述方法在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代三次。用特異免疫血清作中和試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。對(duì)于糞便標(biāo)本中輪狀病毒的初次分離，宜先在原代細(xì)胞上傳幾代適應(yīng)后再傳至MA104細(xì)胞大量增殖。一般實(shí)驗(yàn)室限于條件，不宜做到病毒分離。諾如病毒檢驗(yàn)標(biāo)本采集諾如病毒檢測(cè)首選糞便標(biāo)本。糞便標(biāo)本在出現(xiàn)癥狀后2d～3d內(nèi)采集，置于無(wú)菌容器內(nèi)，每份標(biāo)本量約5g或5mL以上。嘔吐物每份標(biāo)本采集5g或5mL以上，置于無(wú)菌容器內(nèi)。肛拭子：肛拭棉簽放入無(wú)菌帶蓋裝有2mL無(wú)菌PBS緩沖液（10mmol/L，PH7.0～7.4）中。采集病例急性期（發(fā)病5d內(nèi)）和恢復(fù)期（發(fā)病3周～6周）血清，分離血清后長(zhǎng)期保存，－20℃長(zhǎng)期保存。血清標(biāo)本不建議做常規(guī)診斷。標(biāo)本保存和運(yùn)輸同輪狀病毒6.1.3。實(shí)驗(yàn)室檢查電鏡檢查實(shí)驗(yàn)方法同輪狀病毒電鏡檢查。免疫學(xué)檢測(cè)ELISA方法商品化抗原診斷試劑盒可用于諾如病毒的檢測(cè)，具體操作按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。由于ELISA方法敏感性較低，ELISA檢測(cè)陰性標(biāo)本仍需核酸檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)?？贵w檢測(cè)恢復(fù)期血清與諾如病毒病毒樣顆粒（VLP）結(jié)合較急性期血清4倍及以上增加，不用于常規(guī)檢測(cè)。RT-PCR實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeRT-PCR）Real-timeRT-PCR是檢測(cè)諾如病毒金標(biāo)準(zhǔn)。按常規(guī)提取病毒RNA，商品化諾如病毒Real-timeRT-PCR檢測(cè)試劑盒可用來(lái)檢測(cè)諾如病毒，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，也可按表B.15引物和探針進(jìn)行檢測(cè)。多重?zé)晒舛縍T-PCR擴(kuò)增諾如病毒的引物和探針?lè)纸M引物/探針序列（5'-3'）工作濃度/nmmol/LGICog1FCGYTGGATGCGITTYCATGA400Cog1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400probeRing1EFAM–TGGACAGGRGAYCGC–MGBNFQ200GIICog2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG400Cog2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400probeRing2Cy5或QUASAR670–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQ2200逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）Real-timeRT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的核酸，進(jìn)一步用傳統(tǒng)RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)序列與參考株的系統(tǒng)進(jìn)化分析，可進(jìn)行基因分型，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)椴糠志酆厦负鸵職^(qū)，引物詳見(jiàn)表B.16。RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按選擇的試劑及擴(kuò)增儀有所不同。擴(kuò)增產(chǎn)物按常規(guī)進(jìn)行電泳及結(jié)果判斷。用于諾如病毒基因分型的引物基因型引物序列（5'-3'）產(chǎn)物大小/bpGIMON432（+）TGGACICGYGGICCYAAYCA579G1SKR（-）CCAACCCARCCATTRTACAGIIMON431（+）TGGACIAGRGGICCYAAYCA570G2SKR（-）CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT腸腺病毒檢驗(yàn)標(biāo)本采集同B.6.1。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)膠體金免疫層析試驗(yàn)：有商品試劑盒供應(yīng)，試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行。ELISA方法：有商品試劑盒供應(yīng)，試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行?？贵w檢測(cè)：恢復(fù)期血清與抗原結(jié)合較急性期血清4倍及以上增加。不用于常規(guī)檢測(cè)。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR方法）Real-timePCR檢測(cè)商品化腺病毒Real-timeRT-PCR檢測(cè)試劑盒可用來(lái)檢測(cè)腺病毒，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，也可按以下引物和探針進(jìn)行檢測(cè)（表B.17）。用于腸腺病毒檢測(cè)的引物引物/探針序列（5'-3'）JTVFFAACTTTCTCTCTTAATAGACGCCJTVFRAGGGGGCTAGAAAACAAAAJTVFAPFAM-CGAAGAGTGCCCGTGTCAGC-BHQ傳統(tǒng)PCR檢測(cè)采用與Ad40及Ad41六鄰體基因高度保守區(qū)互補(bǔ)引物擴(kuò)增腺病毒DNA。上游引物Ad1的序列為:5'-TTCCCCATGGCICAYAACAC-3'；下游引物Ad2的序列為:5'-CCCTGGTAKCCRATRTTGTA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為482bp。通過(guò)測(cè)序和序列分析進(jìn)行基因分型。病毒分離細(xì)胞系腺病毒40和41型能在Grahm293細(xì)胞、張氏結(jié)膜細(xì)胞和第三代食蟹猴腎細(xì)胞（tCMKcells）中生長(zhǎng)。Grahm293細(xì)胞目前是腺病毒最敏感的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)基成分EagLe's培養(yǎng)液、3%谷氨酰胺、青/鏈霉素（10000U/mL，10000μg/mL）、胎牛血清、7.5%碳酸氫鈉。生長(zhǎng)液100mLEagLe’s生長(zhǎng)液中包含EagLe’s液84mL、胎牛血清10mL、青∕鏈霉素2mL、3%谷氨酰胺1mL，7.5%碳酸氫鈉調(diào)液體pH至7.2～7.4。維持液100mLEagLe’s維持液中包含EagLe’s液92mL、胎牛血清2mL、青∕鏈霉素2mL、1%谷氨酰胺1mL，7.5%的碳酸氫鈉調(diào)液體的pH至7.2～7.4。實(shí)驗(yàn)步驟取糞便上清液0.2mL～0.5mL先加青/鏈霉素0.2mL4℃過(guò)夜處理或用0.45μm除菌濾器過(guò)濾，接種到生長(zhǎng)至80%單層細(xì)胞管，37℃吸附1h，棄去標(biāo)本液，換上細(xì)胞維持液，置37℃孵育至出現(xiàn)細(xì)胞病變，按照上述方法在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代三次。用特異免疫血清作中和試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。腸腺病毒40/41型感染Grahm293細(xì)胞12d后，細(xì)胞出現(xiàn)特征性病變，細(xì)胞腫脹變圓，成堆呈葡萄狀。在傳代培養(yǎng)第二代時(shí)10d左右出現(xiàn)局灶性病變，15d后病變完全。隱孢子蟲(chóng)檢驗(yàn)標(biāo)本收集糞便、嘔吐物或小腸液按照常規(guī)方法收集，如不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可放在4℃保存，存放不超過(guò)72h。病原學(xué)鑒定標(biāo)本制備糞便直接涂成1.5cm大小的糞膜（厚度以覆在報(bào)紙上時(shí)可透過(guò)圖片看到字為宜），在自然或37℃下使之充分干燥后，滴加無(wú)水甲醇固定3min～5min。金胺—酚染色法試劑配制0.1%金胺—酚染色液（第一液）：金胺0.1g，苯酚5g，蒸鎦水定容至100mL，用蒸餾水溶解苯酚，緩慢加入金胺，用濾紙過(guò)濾到棕色試劑瓶中，室溫貯藏；3%鹽酸酒精（第二液）：鹽酸3mL，95%酒精100mL，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中，室溫貯藏；0.5%高錳酸鉀液（第三液）：高錳酸鉀0.5g，蒸鎦水100mL，將高錳酸鉀加到蒸餾水中，充分?jǐn)嚢?，過(guò)濾至棕色試劑瓶中，室溫貯藏。染色步驟滴加第一液于晾干的糞膜上，10min～15min后自來(lái)水漂洗；滴加第二液，脫色1min后水洗；滴加第三液，染色1min后水洗，晾干后，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。染色所用的金胺—酚和高錳酸鉀溶液配制后，不宜超過(guò)1m，否則影響染色結(jié)果。結(jié)果判定染色后的標(biāo)本在熒光鏡低倍下卵囊為一圓形亮點(diǎn)，高倍下發(fā)出乳