武義縣高中生物實(shí)驗(yàn)技能提升培訓(xùn)(二)

武義縣高中生物實(shí)驗(yàn)技能提升培訓(xùn)(二)武義縣高中生物實(shí)驗(yàn)技能提升培訓(xùn)（二）組織單位：縣教研室指導(dǎo)專家：藍(lán)偉偵培訓(xùn)內(nèi)容：幾種植物染色體體核型分析藍(lán)偉偵在作“染色體核型分析”講座材料：表1紫景天和四種龍葵的性狀比較種類果實(shí)顏色果實(shí)特征分布區(qū)紫景天黃果龍葵少花龍葵浙江龍葵蘇聯(lián)龍葵褐色黃綠色亮黑紫色黑色黑紫色果小，卵狀橢圓形粒細(xì)小，白中稍帶黃粒較小，白色稍泛綠粒較小,白色粒大,乳白色全國(guó)東北零星分布南方各省區(qū)浙江北部北方各省區(qū)紫景天、少花龍葵、浙江龍葵、黃果龍葵和蘇聯(lián)龍葵種子，由湖州師范學(xué)院張海洋教授提供，通過(guò)培養(yǎng)種子并獲得相應(yīng)的根尖。表2各稻種的染色體數(shù)、基因組及地理分布稻種名稱Nameofspecies染色體數(shù)目Chromosomenumber基因組Genome分布Distribution（3）預(yù)處理：為了有利于對(duì)有絲分裂中染色體的觀察和計(jì)數(shù)，在固定之前應(yīng)對(duì)剪下的根尖進(jìn)行預(yù)處理，這樣可以改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散。預(yù)處理的方法有低溫預(yù)處理和藥物預(yù)處理。

=1\*GB3①低溫預(yù)處理：將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)，置于4℃的冰箱中進(jìn)行低溫處理24小時(shí)，此法效果很好，對(duì)染色體無(wú)破壞作用，染色體縮短均勻。=2\*GB3②藥物預(yù)處理：常用藥物有秋水仙素溶液、對(duì)二氯苯溶液、8-羥基喹啉等。（4）根尖的低滲：低滲是為了使染色體更好的分散。在固定前用0.075mol/LKCl室溫下處理30分鐘，酶解后用蒸餾水低滲15～30分鐘，使染色體分散效果更好。（5）固定：新鮮3：1甲醇：冰乙酸的固定液固定2～3h或4℃過(guò)夜。（借助于物理方法或化學(xué)藥物的作用，迅速滲入組織和細(xì)胞將之殺死，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物盡可能保持生活時(shí)的完整和真實(shí)狀態(tài)。固定時(shí)，將預(yù)處理過(guò)的根尖用蒸餾水沖洗兩次(約5分鐘)。然后移入卡諾氏固定液中，在4℃～15℃條件下固定20～24小時(shí)后用70％酒精沖洗2次轉(zhuǎn)入70％酒精中。在（6）水洗：每隔5分鐘洗一次，洗凈。（7）解離：2%纖維素酶、2%果膠酶、1%解析酶混合（2：2：1），28℃有酸解和酶解兩種方法：=1\*GB3①酸解：將根尖從固定液中取出，用蒸餾水漂洗，然后放入已經(jīng)在60℃水浴鍋中預(yù)熱的1mol/LHCI中，在60℃恒溫條件下解離10～15分鐘，當(dāng)根尖透明呈米黃色時(shí)取出，用蒸餾水沖洗2～3次。=2\*GB3②酶解：將根尖從固定液中取出，放在0.1mol/L醋酸鈉中漂洗，用刀片切除根冠以及延長(zhǎng)區(qū)(根尖較粗的蠶豆，可以把分生組織切成2～3片)，把根尖分生組織放到醋酸鈉配制的2％的纖維素酶和2%果膠酶的等量混合液中，在25～28℃條件下處理4～5小時(shí)。此時(shí)組織已被酶液浸透而呈淡褐色，質(zhì)地柔軟而仍可用鑷子夾起，用滴管將酶液吸掉，再滴上0.1mol/L醋酸鈉，使組織中的酶液漸漸滲出，再放入45％醋酸。（8）后低滲：將解離后的根尖放在蒸餾水中沖洗2～3次(約10分鐘)。酶解后的根尖放入蒸餾水中浸泡10～15分鐘，然后再?zèng)_洗2～3次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。低滲后的根尖放入70%酒精后備用。洗載片的洗滌如下：①1mol/LHCl中30分鐘以上=2\*GB3②自來(lái)水（每片單獨(dú)漂洗），接著用雙蒸水洗=3\*GB3③95%酒精浸泡30分鐘以上（9）染色體制片：小心吸去酶液，水洗幾次，吸取1～2個(gè)根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂開(kāi)，火焰干燥。在普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，通過(guò)鏡檢初步篩選一批染色體分裂像較多的制片，并用記號(hào)筆做好標(biāo)記以便做熒光染色備用。（10）熒光染料DAPI復(fù)染配制一定濃度的熒光染料DAPI，在暗室里對(duì)紫景天染色體制片進(jìn)行了熒光染色體。（11）熒光顯微鏡鏡檢及拍攝把復(fù)染的染色體制片利用熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，并且對(duì)染色體各時(shí)期分裂像都進(jìn)行了一定量的拍照，并把拍攝好的照片在硬盤里備份保存。（12）圖像的處理及分析我們把拍攝好的染色體照片進(jìn)行分析，首先選取分散較好的前中期染色體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并利用Photoshop軟件進(jìn)行圖片處理和核型分析，SPOTadvanced軟件測(cè)量染色體長(zhǎng)度，同時(shí)利用excel表對(duì)相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，并構(gòu)建其相應(yīng)的核型模式圖。5.2龍葵染色體制片及觀察5.2.1龍葵的生根培養(yǎng)⑴浸種：分別取兩種龍葵的適量的種子于燒杯中，室溫下浸種一天。⑵發(fā)芽：培養(yǎng)皿中墊濕濾紙一層，種子分散其上，留一些間隔，不能堆積，25-30℃5.2.2種子培養(yǎng)過(guò)程觀察除了勤換水，保證種子處在最佳培養(yǎng)條件下外，還應(yīng)及時(shí)取根尖。當(dāng)根長(zhǎng)至1-1.5cm時(shí)，切取1cm左右的根尖（早上10：00-11：00取根尖可以得到更好的分裂相），根尖太短，所得分裂細(xì)胞數(shù)目太少，不利于染色體觀察，太長(zhǎng)，不利于制片。5.2.3根尖染色體制片⑴預(yù)處理為了有利于對(duì)有絲分裂中染色體的觀察和計(jì)數(shù)，在固定之前應(yīng)對(duì)剪下的根尖進(jìn)行預(yù)處理，這樣可以改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成．促使染色體縮短和分散。預(yù)處理的方法有低溫預(yù)處理和藥物預(yù)處理。

①低溫預(yù)處理：將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)，置于4℃②藥物預(yù)處理：常用藥物有秋水仙素溶液、對(duì)二氯苯溶液、8-羥基喹啉等。⑵根尖的低滲低滲是為了使染色體更好的分散。在固定前用0.075mol/LKCl室溫下處理30分鐘，酶解后用蒸餾水低滲15-30分鐘，使染色體分散效果更好。

⑶固定與水洗借助于物理方法或化學(xué)藥物的作用，迅速滲入組織和細(xì)胞將之殺死，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物盡可能保持生活時(shí)的完整和真實(shí)狀態(tài)。固定時(shí)，將預(yù)處理過(guò)的根尖用蒸餾水沖洗兩次(約5分鐘)。然后移入卡諾氏固定液中，在4-15℃條件下固定20-24小時(shí)后用70％酒精沖洗2次轉(zhuǎn)入70％酒精中。在4℃冰箱內(nèi)保存，保存時(shí)間最好不超過(guò)二個(gè)月。經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間保存的材料，進(jìn)行觀察前可以換用固定液再處理一次效果較好。或?qū)㈩A(yù)處理過(guò)的根尖放入0.075mol/LKCI溶液中低滲20分鐘，然后在蒸餾水中沖洗2-3次(約10分鐘)待用。

⑷解離使分生組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解．細(xì)胞壁軟化或部分分解．使細(xì)胞和染色體容易分散壓平。解離有酸解和酶解兩種方法：

①酸解：將根尖從固定液中取出，用蒸餾水漂洗．然后放入已經(jīng)在60℃水浴鍋中預(yù)熱的1mol/LHCI中，在60℃恒溫條件下解離10-15分鐘，當(dāng)根尖透明呈米黃色時(shí)取出，用蒸餾水沖洗2-3次。

②酶解：將根尖從固定液中取出，放在0.1mol/L醋酸鈉中漂洗，用刀片切除根冠以及延長(zhǎng)區(qū)(根尖較粗的蠶豆，可以把分生組織切成2-3片)，把根尖分生組織放到醋酸鈉配制的2％的纖維素酶和2%果膠酶的等量混合液中,在25-⑸后低滲將解離后的根尖放在蒸餾水中沖洗2-3次(約10分鐘)。酶解后的根尖放入蒸餾水中浸泡10-15分鐘，然后再?zèng)_洗2-3次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。低滲后的根尖放入70%酒精后備用。⑹洗載玻片①將載玻片置于1mol/LHCl中30min以上。②用自來(lái)水（每片單獨(dú)漂洗）漂洗，然后用蒸餾水漂洗。③將漂洗后的載玻片置于95%酒精中浸泡30min以上。5.2.4染色體制片用火焰干燥法制片：小心吸去酶液，水洗幾次，吸取1～2個(gè)根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂開(kāi)，火焰干燥。用光學(xué)顯微鏡初步鏡檢，篩選備用。5.2.5龍葵染色體制片染色及觀察Giemsa染色（1）準(zhǔn)備染液用pH為6.8-7.0的Sorense緩沖液，按Giemsa染液：Sorense緩沖液為1：20或1：40比例取Giemsa染液和Sorense緩沖液混合配成染色液。染色液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間不超過(guò)48小時(shí)。緩沖液pH值要準(zhǔn)確，否則影響染色效果。（2）Giemsa染色經(jīng)過(guò)2ⅹssc處理后的片子在Giemsa染液中60℃下染色2-3小時(shí)。（3）洗片將經(jīng)Giemsa染色后的片子用自來(lái)水洗去玻片上多余的燃料，自然干燥。熒光染料DAPI復(fù)染配制一定濃度的熒光染料DAPI，在暗室里對(duì)紫景天染色體制片進(jìn)行了熒光染色體。5.2.6鏡檢及拍照晾干的片子在顯微鏡下鏡檢。每種類型隨機(jī)選取30個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目鑒定；每種類型選取染色體分散好的、形態(tài)清晰的5個(gè)細(xì)胞通過(guò)PhotoShop軟件和SPOT軟件結(jié)合G-帶帶型完成染色體核型分析。5.3水稻染色體制片中期染色體制片參照Song和Gustafson(1995)的方法并略作修改。切取生長(zhǎng)旺盛的根尖(1~2mm)，0.075MKCl前低滲處理30min，甲醇/冰醋酸(3:1)固定，雙蒸水充分清洗根尖，2%的果膠酶及纖維素酶1:1混合28oC下酶解3~4h，雙蒸水后低滲30min火焰干燥制片，-20o藥用野生稻減數(shù)分裂染色體制片參照Kurata等(1981)程序稍加修改，在花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)期，以卡諾氏固定液固定幼穗后，從小穗中剝?nèi)』ǚ勰?，?%果膠酶(SERVA)和2%纖維素酶(SERVA)1:1混合，在28oC下酶解1.5~2.5h左右，吸去酶液，輕輕水洗3次，火焰干燥法制片，亦可用滴片法制備粗線期染色體，即將酶解好的花粉囊，加雙蒸水輕輕吹打，使其細(xì)胞完全散開(kāi)，后低滲15min，3000~3600rpm離心5min，然后加固定液重新固定10~15min，換新鮮固定液，懸浮滴片，火焰干燥后-20oC保存?zhèn)溆谩?.4染色體原位雜交及信號(hào)檢測(cè)5.4.1原位雜交參照Gustafson和Dille(1992)方法并略作修改。1)染色體制片60℃烘片1h。2)37℃于RNaseA(10μg/ml，用2×SSC稀釋)溶液中處理1h。3)4％多聚甲醛(2×SSC)室溫下處理10min。4)2×SSC，室溫下處理5min。5)2×SSC，室溫下處理10min。6)70%甲酰胺70℃處理3.5min。7)于-20℃70%、95%、100%乙醇中各處理5min。8)染色體制片在室溫下充分干燥。9)雜交液90℃變性10min后，迅速于冰上放置20min。雜交液配方見(jiàn)表1。表5FISH雜交液配方探針類型去離子甲酰胺硫酸葡萄糖探針量鮭精DNA(ssDNA)20×SSCSDS探針50%8%100ng2μg10%0.1%10)加50μl雜交液至染色體制片上，蓋24×50mm的蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，80℃共變性1.5~3min(變性時(shí)間根據(jù)不同染色體制片而定)，染色體制片于37℃保濕皿中孵育24h。2.3.7.2信號(hào)檢測(cè)對(duì)于中期、間期、粗線期染色體制片，雜交后的熒光檢出程序包括以下步驟：1）洗片：20％甲酰胺，42℃洗10min；2×SSC，42℃10min；0.2×SSC，42℃10min；1×PBS室溫洗10min。2）涼干片子每張片子加50μl鏈親和素-Cy3(streptavidin-Cy3)(0.4μl1mg/ml的鏈親和素-Cy3用1%BSA/PBS稀釋成50μl)或抗地高辛-FITC(anti-Digoxigenin-FluoresceinFabFragment)(3μl200μg/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀釋成50μl)，37℃于保濕皿中溫育1h。室溫1×PBS洗3次，每次5min。3）涼干片子每張片子加50μl生物素鏈親和素(BiotinylatedStreptavidin)(0.4μl1mg/ml的生物素鏈親和素用1%BSA/PBS稀釋成50μl)或兔抗羊-生物素偶聯(lián)物(rabbitanti-goatbiotinconjugated)(3μl200μg/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀釋成50μl)，37℃于保濕皿中溫育1h。室溫1×PBS洗3次，每次5min。4)涼干片子每張片子加50μl鏈親和素-Cy3(streptavidin-Cy3)(0.4μl1mg/mL的鏈親和素-Cy3用1%BSA/PBS稀釋成50μl)，37℃于保濕皿中溫育1h。室溫1×PBS洗3次，每次5min。5）每張制片加40μl10μg/mLDAPI復(fù)染，OLYMPUSBX61顯微鏡觀察，用CaseDataManagerExpo2.1.1圖象系統(tǒng)控制的Cool-1300QSCCD(VDS，Germany)照相系統(tǒng)攝取圖片，F(xiàn)ISHViewEXPO2.0軟件圖片處理和核型分析。6實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)培訓(xùn)課件ppt。作者簡(jiǎn)介：藍(lán)偉偵性別：男民族：畬族出生年月日：1980年12月13日，籍貫：浙江武義簡(jiǎn)歷：1999.09－2003.07本科中南民族大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)2003.09－2006.07碩士中南民族大學(xué)分析化學(xué)專業(yè)2006.08－2009.07浙江湖州師范學(xué)院生科院2009.08－至今武義縣第三中學(xué)簡(jiǎn)介：項(xiàng)目負(fù)責(zé)人近年來(lái)先后參加了多項(xiàng)科研項(xiàng)目，包括國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863）（批準(zhǔn)號(hào)：2004AA227120），教育部留學(xué)回國(guó)人員啟動(dòng)基金（批準(zhǔn)號(hào)：BZY04003），中國(guó)博士后科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：20040350574），武漢市青年科技晨光計(jì)劃（批準(zhǔn)號(hào)：2004500607135）。負(fù)責(zé)人以第一作者發(fā)表或待發(fā)表文章：1.LanWZ,QinR,LiG,HeGC.ComparativeanalysisofA,B,CandDgenomesinthegenusOryzawithC0t-1DNAofCgenome.ChineseScienceBulletin,2006,51(14):1710-1720(SCI)2.LanWZ,HeGC,WangCY,WuSJ,QinR.ComparativeAnalysisofGenomesinOryzasativa,O.officinalis,andO.meyerianawithC0t-1DNAandGenomicDNAofCultivatedRice.Agricul