高中生物第五章第二節(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增NDA片段1新人教版選修1

關(guān)于高中生物第五章第二節(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增NDA片段1新人教版選修1★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù),1993年諾貝爾獎基礎(chǔ)知識第2頁,共30頁，星期六，2024年，5月㈠.DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第3頁,共30頁，星期六，2024年，5月通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端3.多脫氧核苷酸鏈得形成多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖磷酸二酯鍵第4頁,共30頁，星期六，2024年，5月4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對，

一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第5頁,共30頁，星期六，2024年，5月㈡.DNA的復(fù)制2.時期有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體。1.概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。4.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第6頁,共30頁，星期六，2024年，5月⑴.邊解旋邊復(fù)制(過程）5.復(fù)制特點(diǎn)⑵.半保留復(fù)制（結(jié)果）6.遵循原則：堿基互補(bǔ)配對原則7.精確復(fù)制的原因8.復(fù)制的意義DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性⑴規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板⑵堿基互補(bǔ)配對能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行第7頁,共30頁，星期六，2024年，5月小結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本知識使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸引物提供能量ATP催化合成DNA子鏈DNA聚合酶合成子鏈的原料4種脫氧核苷酸提供DNA復(fù)制的模板DNA母鏈打開DNA雙鏈解旋酶在DNA復(fù)制中的作用參與的成分第8頁,共30頁，星期六，2024年，5月㈢.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）2.TaqDNA聚合酶特性

高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化不能從頭合成DNA，只能從DNA母鏈的的3′端開始延伸DNA鏈，或者總是從子鏈的5′端向3′端延伸因此，DNA復(fù)制需要引物。1.定義：是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。第9頁,共30頁，星期六，2024年，5月第10頁,共30頁，星期六，2024年，5月3.PCR原理⑴在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。⑵當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈。⑶PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。第11頁,共30頁，星期六，2024年，5月4.需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)緩沖液、DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出。5.PCR技術(shù)的特點(diǎn)：第12頁,共30頁，星期六，2024年，5月6.細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制PCR模板(母鏈)細(xì)胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入原料:dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境緩沖液第13頁,共30頁，星期六，2024年，5月⑴PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸7.細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點(diǎn)⑵PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的8.PCR的重要應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等。第14頁,共30頁，星期六，2024年，5月1、PCR儀㈠.設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。實(shí)驗(yàn)操作第15頁,共30頁，星期六，2024年，5月2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。第16頁,共30頁，星期六，2024年，5月1.準(zhǔn)備2.移液㈡.實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑?；旌虾笊w嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合⑴過程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。4.離心⑵離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。第17頁,共30頁，星期六，2024年，5月將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應(yīng)循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸.第18頁,共30頁，星期六，2024年，5月⑴.變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。⑵.復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。⑶.延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。第19頁,共30頁，星期六，2024年，5月模板鏈模板鏈PCR循環(huán)第一步：高溫變性第20頁,共30頁，星期六，2024年，5月模板鏈模板鏈引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第21頁,共30頁，星期六，2024年，5月模板鏈模板鏈引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第22頁,共30頁，星期六，2024年，5月模板鏈模板鏈第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個靶序列第23頁,共30頁，星期六，2024年，5月PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時要注意做到：6.注意事項(xiàng)⑴隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；⑵分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭第24頁,共30頁，星期六，2024年，5月㈠.理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計算課題成果評價1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a×2n㈡.實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。第25頁,共30頁，星期六，2024年，5月⑵對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值⑶計算DNA含量(g)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.022.過程⑴稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋.第26頁,共30頁，星期六，2024年，5月光吸收波長／nm260240220280