（高清版）GBT 38482-2021 動(dòng)物源性I型膠原蛋白成分測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

動(dòng)物源性I型膠原蛋白成分測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳法2021-12-31發(fā)布2022-07-01實(shí)施國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、上海海洋大學(xué)、中國(guó)海洋大學(xué)、山東弘博標(biāo)準(zhǔn)化服務(wù)事務(wù)所、中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所。1動(dòng)物源性I型膠原蛋白成分測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS)測(cè)定動(dòng)物源性I型膠原蛋白成分的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物源性膠原蛋白產(chǎn)品中I型膠原蛋白成分的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。膠原蛋白collagen以純化的(非交聯(lián)的)I型膠原蛋白為原料制備的左手螺旋的重復(fù)Gly-X-Y序列的3條肽鏈相互盤繞成右手超螺旋結(jié)構(gòu)特征的結(jié)構(gòu)蛋白。注：Gly是甘氨酸，X通常是脯氨酸，Y通常是羥脯氨酸或羥賴氨酸。I型膠原蛋白typeIcollagen由2條αl鏈和1條α2肽鏈組成的具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白。4原理利用I型膠原蛋白具有其他蛋白質(zhì)所沒(méi)有的三股螺旋結(jié)構(gòu)，配合特異性的膠原酶作用，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)對(duì)牛血清白蛋白(BSA)染色極限的確定，利用SDS法測(cè)定I型膠原蛋白的成分。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1細(xì)菌膠原酶。5.2牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)符合GB/T6682中的一級(jí)水規(guī)定。5.420mmol/L磷酸二氫鈉溶液，pH7.4。2稱取無(wú)水磷酸二氫鈉0.54g,加水，攪拌，定容至1L。測(cè)試pH值，微調(diào)至pH7.4即可。5.53%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸溶液。量取3mL的冰乙酸，注入50.00mL水中，定容至100.00mL,混勻。5.60.5mg/mL的鹽酸溶液。取1mol/L鹽酸溶液65.00mL,加水定容至1000mL。5.7胃蛋白酶溶液。用20mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH7.4,內(nèi)含0.1mmol/L氯化鈣)溶解胃蛋白酶，配成含適當(dāng)活性單位的胃蛋白酶溶液(例如1.25U/mL)。5.8膠原酶溶液。用20mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH7.4,內(nèi)含0.1mmol/L氯化鈣)溶解膠原酶，配成含適當(dāng)活性單位的膠原酶溶液(例如1.25U/mL)。5.9牛血清白蛋白(BSA)溶液。用水將BSA稀釋成梯度濃度，質(zhì)量濃度在0.001mg/mL～0.025mg/mL。5.101mg/mLI型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。用3%的乙酸將I型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich,純度≥99%)稀釋成質(zhì)量濃度為1mg/mL的溶液。稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷，加適量水溶解，用0.5mg/mL的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8,用水定容至50.00mL,4℃下保存。5.121.5mol/L分離膠緩沖液貯備液，pH為8.8。取9.08g三羥甲基氨基甲烷，加適量水溶解，用0.5mg/mL的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.8,用水定容至50.00mL,4℃下保存。5.13電泳緩沖液(5×),pH8.3。稱取15.1g三羥甲基氨基甲烷，72.0g甘氨酸，加入十二烷基磺酸鈉5g,溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.3,加水定容至1000.00mL,使用前稀釋5倍。5.14樣品緩沖液(5×)。溴酚藍(lán)加入水中溶解，加水定容至40mL。5.151.00g/L考馬斯亮藍(lán)染色液。稱取1.00g考馬斯亮藍(lán)R-250,加入450.00mL甲醇、100.00mL冰醋酸、450.00mL蒸餾水。5.16考馬斯亮藍(lán)脫色液。量取400mL甲醇、100mL冰醋酸、500mL蒸餾水，配制成1L的脫色液。6儀器設(shè)備6.1分析天平：感量0.0001g。6.2冷凍離心機(jī)：12000r/min,4℃。6.3磁力攪拌器。6.4具塞離心試管6.5電泳儀。6.6凝膠成像系統(tǒng)。GB/T38482—20217測(cè)定步驟7.1試樣制備7.1.1液體樣品取10mL樣品，4℃磁力攪拌4h,形成勻漿，10000r/min離心30min,上清液即為酸溶性膠原蛋白。隨后，用3%的乙酸將酸溶性膠原蛋白稀釋成體積濃度為1%的溶液。稱取1g樣品，精確到0.1mg,加適量3%的乙酸溶解，封口后于4℃磁力攪拌器攪拌4h,定容至10mL,再按液體樣品操作。7.1.3凝膠狀樣品用3%的乙酸將酸溶性膠原蛋白稀釋成膠原蛋白質(zhì)量濃度為1mg/mL～2mg/mL的溶液。7.2I型膠原蛋白成分的測(cè)定7.2.1考馬斯亮藍(lán)對(duì)BSA的染色極限分析取各濃度BSA溶液20μL上樣。按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)0541電泳法第四法規(guī)定的方法進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)脫色后的膠片進(jìn)行分析，確定考馬斯亮藍(lán)對(duì)BSA的染色極限。7.2.2樣品中I型膠原蛋白成分測(cè)定樣品a:用3%的乙酸溶解樣品，使樣品質(zhì)量濃度為1mg/mL。樣品b:用膠原酶溶液溶解樣品，配制成樣品質(zhì)量濃度和樣品a相同，于37℃水浴中加熱4h。樣品c:取超純水加膠原酶溶液，使膠原酶的質(zhì)量濃度與樣品b的質(zhì)量濃度相同。上樣分析：將上述樣品與2×的樣品緩沖液等體積混合后，置于100℃水浴中1min～2min,取出進(jìn)行SDS電泳。待測(cè)樣品、BSA(取染色極限量)和分子量標(biāo)準(zhǔn)品上樣體積均為20μL,電泳電壓110V。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)脫色后的膠片進(jìn)行分析，記錄條帶光密度。8結(jié)果計(jì)算8.1當(dāng)樣品b中所有條帶光密度之和與樣品c中所有條帶光密度之和不相同時(shí)，按式(1)計(jì)算：X=A-(B-C) (1)式中：X——待測(cè)樣品中I型膠原蛋白成分含量，%;A——樣品a中所有條帶光密度之和，%;B——樣品b中所有條帶光密度之和，%;C——樣品c中所有條帶光密度之和，%