PI3K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

PI3K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義［摘要］目的探討PI3K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)人結(jié)腸癌組織芯片中結(jié)腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中PI3K蛋白的表達(dá)，分析PI3K蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析。結(jié)果PI3K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較癌旁正常黏膜組織明顯上調(diào)（P＜0.05），PI3K蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤大小等無(wú)關(guān)。生存分析結(jié)果示PI3K陽(yáng)性表達(dá)組患者生存率明顯低于陰性表達(dá)組患者（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)I3K蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并可能與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。［關(guān)鍵詞］結(jié)腸癌；PI3K；免疫組化；預(yù)后；ExpressionofPI3Kincoloncanceranditsclinicalvalue［Abstract］ObjectiveToobservetheexpressionofPI3Kincoloncanceranditsclinicalvalue.MethodsTheexpressionofPI3Kproteininhumancoloncancertissuesandadjacentnormalmucosatissueswasdetectedbyimmunohistochemistryincoloncancertissuemicroarray.TherelationshipbetweenPI3Kproteinexpressionandclinicopathologicalfeaturesofcoloncancerwasanalyzed,thenasurvivalanalysiswasperformed.ResultsTheexpressionofPI3Kproteinwassignificantlyup-regulatedincoloncancertissuescomparedwithnormaladjacentmucosatissues(P<0.05).TheexpressionofPI3Kproteinwassignificantlycorrelatedwiththeclinicalstageandlymphnodemetastasisofcoloncancer(P<0.05),andwereunrelatedtothepatient'sage,gender,degreeofdifferentiationandtumorsize.SurvivalanalysisshowedthatthesurvivalrateofPI3Kpositivegroupwassignificantlylowerthanthatofthenegativegroup(P<0.05).ConclusionPI3Kproteinwashighlyexpressedincoloncancertissuesandmaybeassociatedwithmetastasisandpoorprognosisofcoloncancer.［Keywords］coloncancer,PI3K,immunohistochemistry,prognosis結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，導(dǎo)致死亡的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移，預(yù)后差A(yù)DDINNE.Ref.{2F159FED-6CA7-4535-8C7A-5FE945B7FE26}[1]。如何準(zhǔn)確判斷結(jié)腸癌患者預(yù)后并采取相應(yīng)的治療成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。PI3K即磷脂酰肌醇3激酶，活化的P13K可磷酸化其底物二磷脂酰肌醇為三磷酸磷脂酰肌醇，三磷酸磷脂酰肌醇可作為第二信使進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。已有較多研究證實(shí)PI3K發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，較大程度地影響著腫瘤患者預(yù)后ADDINNE.Ref.{A2FC4E2D-B52D-465A-9DCE-280632E63CBB}[2-5]。但PI3K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本文運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)腸癌組織芯片中PI3K蛋白表達(dá)，分析PI3K蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析，探討PI3K蛋白與結(jié)腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系。1材料和方法1.1材料1.1.1組織芯片本實(shí)驗(yàn)所用的1張組織芯片購(gòu)買(mǎi)于上海芯超公司，芯片編號(hào)為OD-CT-DgCo107，每張芯片上含有75例結(jié)腸癌病人的癌組織及癌旁正常黏膜組織各1點(diǎn)，共150點(diǎn)，每塊組織厚4um，直徑1.5mm，每例患者術(shù)前均未接受放化療，其中高分化者10例，中分化者53例，低分化者12例；DukesA期12例，DukesB期23例，DukesC期31例，DukesD期9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例；男性38例，女性37例；年齡分布為30-82歲，其中年齡大于60歲者49例，小于60歲者26例，標(biāo)本均經(jīng)HE染色驗(yàn)證。75例患者均在2012年1月至2013年1月行手術(shù)治療，所有患者均有完整的隨訪資料，以最后一次隨訪日期或死亡日期為隨訪結(jié)束點(diǎn)，隨訪時(shí)間以月計(jì)算，隨訪截止日期為2012年10月，生存期為手術(shù)日期到隨訪結(jié)束日期或死亡日期，最短隨訪時(shí)間為1月，最長(zhǎng)隨訪日期為66月。1.1.2主要試劑鼠抗人單克隆抗體PI3K購(gòu)自于美國(guó)SANTA公司，即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒、DAB顯示試劑盒購(gòu)自于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。1.2方法1.2.1免疫組化方法結(jié)腸癌組織芯片經(jīng)脫蠟水化，檸檬酸鹽高溫修復(fù)抗原，PBS緩沖液漂洗后以3%過(guò)氧化氫-甲醇孵育，清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS漂洗后滴加正常山驢羊血清封閉，室溫孵育，PBS沖洗，滴加1:300PI3K抗體，4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS漂洗后再滴加二抗，室溫孵育30分鐘，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，用已知陽(yáng)性染色的結(jié)腸癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，樹(shù)膠干后顯微鏡下拍照。1.2.2免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)及觀察評(píng)分綜合目的蛋白表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比例、陽(yáng)性染色強(qiáng)度兩個(gè)指標(biāo)評(píng)分。陽(yáng)性表達(dá)分布范圍標(biāo)準(zhǔn)：（1）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%，0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%-25%，1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%-50%，2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%-75%，3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%，4分。（2）染色程度強(qiáng)弱評(píng)分：陰性染色記0分；淡黃色染色，記1分；棕黃色，記2分；染色呈棕褐色，記3分。最終評(píng)分結(jié)果由兩位病理學(xué)專(zhuān)家雙盲分別按上述一種評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分再相加所得。結(jié)果評(píng)判：0分判為陰性表達(dá)（-）；1-2分判為弱陽(yáng)性表達(dá)（＋）；3-5分判為中等陽(yáng)性表達(dá)（＋＋）；6-7分判為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（＋＋＋）。1.2.3分析RhoGEF蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析方法采用Spearman相關(guān)分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS19.0軟件。以P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1PI3K蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)及與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系由于脫片的原因，本研究分析了64例結(jié)腸癌組織、68例癌旁正常粘膜中PI3K的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌、癌旁正常粘膜中PI3K蛋白陽(yáng)性定位于胞漿表達(dá)，陽(yáng)性染色呈棕黃色或棕褐色（圖1A-D）。對(duì)癌和癌旁正常黏膜中PI3K的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示癌組織中PI3K表達(dá)陽(yáng)性率為71.8%，癌旁正常黏膜PI3K表達(dá)陽(yáng)性率為51.5%，P=0.016，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癌組織中PI3K的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜組織（表1）。進(jìn)一步分析PI3K的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果表明PI3K的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小等無(wú)關(guān)（表2）。圖1BPI3K在結(jié)腸癌組織中陰性表達(dá)，400×圖1BPI3K在結(jié)腸癌組織中陰性表達(dá)，400×圖1API3K在結(jié)腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，400×圖1DPI3K在結(jié)腸癌癌旁正常黏膜組織中陰性表達(dá)，400×圖1DPI3K在結(jié)腸癌癌旁正常黏膜組織中陰性表達(dá)，400×圖1CPI3K在結(jié)腸癌癌旁正常黏膜組織中陽(yáng)性表達(dá)，400×表1PI3K蛋白在結(jié)腸癌和癌旁?xún)山M粘膜中的表達(dá)(例)組別n - + +++++ 陽(yáng)性率%結(jié)腸癌a64182117871.8癌旁正常黏膜b6833206951.5注：利用卡方檢驗(yàn)對(duì)a與b兩組行陽(yáng)性率的比較，X2=5.790，P=0.016,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表2PI3K蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系臨床病理特征nPI3K表達(dá)陰性(n)陽(yáng)性(n)陽(yáng)性率X2值P值年齡≥6044103170.41.5750.210＜602081260.0性別男38102873.70.1510.697女2681869.2分化程度高-中分化52163669.20.3880.533低分化1221083.3Dukes分期A-B期33132060.64.2800.039C-D期3152683.9淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)33141957.56.8910.009有3142787.1腫瘤大小≥5cm37112682.10.1120.738＜5cm2772085.12.2PI3K蛋白的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間影響的分析Kaplan-Meier生存分析顯示，PI3K陽(yáng)性表達(dá)組術(shù)后生存時(shí)間為36.334±3.962月，而陰性表達(dá)組術(shù)后生存時(shí)間為53.027±3.312月，PI3K陽(yáng)性表達(dá)組患者5年生存率為37.8%，PI3K陰性表達(dá)組患者5年生存率為58.9%，陽(yáng)性表達(dá)組生存率明顯低于PI3K表達(dá)陰性組，兩組間生存率經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。圖2結(jié)腸癌患者生存率與PI3K蛋白表達(dá)關(guān)系的生存函數(shù)圖3討論結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程非常復(fù)雜，涉及多因素、多步驟，其中包括多個(gè)原癌基因的激活及抑癌基因的失活、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性變化。PI3K信號(hào)通路活化后可抑制細(xì)胞的凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受、促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管生成，并促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移ADDINNE.Ref.{AA5F5DCD-7564-4903-A125-FAD39FA36C27}[6-8]。大量研究證實(shí)PI3K信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著非常重要的角色。Li等ADDINNE.Ref.{FF10A32D-8902-4E51-A608-D55FB951BC0A}[9]研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可通過(guò)抑制PI3K信號(hào)通路的活性從而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。Hu等ADDINNE.Ref.{6B13332D-304F-442F-A433-B1DB2A85AB00}[10]研究證實(shí)ROCK1蛋白可通過(guò)提高PI3K信號(hào)通路活性而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。Soltani等ADDINNE.Ref.{E6EF1050-3DE7-497D-81BB-75D6C29D22C4}[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-326可通過(guò)抑制PI3K信號(hào)通路活性而抑制乳腺癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移。Huang等ADDINNE.Ref.{69C098D9-D57C-45D8-9A9F-50391755EA41}[12]研究證實(shí)淫羊藿苷可通過(guò)靶向抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。為研究PI3K蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，本文運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)腸癌組織芯片中PI3K蛋白表達(dá)，分析了PI3K蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析。組織芯片(tissuechip)是生物芯片技術(shù)的一個(gè)分支，是將許多不同個(gè)體組織標(biāo)本以規(guī)則陣列方式排布于同一載玻片上，進(jìn)行同一指標(biāo)的原位組織學(xué)研究。該技術(shù)自1998年問(wèn)世以來(lái)，以其大規(guī)模、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)得到大范圍的推廣應(yīng)用。組織芯片技術(shù)可以與其他很多常規(guī)技術(shù)如免疫組織化學(xué)(IHC)、核酸原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、原位PCR等結(jié)合應(yīng)用，它的應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷地拓展ADDINNE.Ref.{7358A53D-0C72-4CA0-9D59-110EF556BB8F}[13]。本研究利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)150點(diǎn)人結(jié)腸癌組織芯片中癌和癌旁正常黏膜組織中PI3K的表達(dá)，分析PI3K蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析，結(jié)果示PI3K在癌組織的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，P＜0.05，證實(shí)在結(jié)腸癌中也存在PI3K蛋白的過(guò)表達(dá)，進(jìn)一步分析PI3K的表達(dá)與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)PI3K的表達(dá)與腫瘤臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，P＜0.05，說(shuō)明PI3K可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，參與結(jié)腸癌病理進(jìn)展過(guò)程，可能起著促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。生存分析結(jié)果示PI3K陽(yáng)性表達(dá)組生存率明顯低于陰性表達(dá)組，P＜0.05，說(shuō)明PI3K蛋白的高表達(dá)預(yù)示結(jié)腸癌患者不良的預(yù)后。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PI3K蛋白表達(dá)上調(diào)可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，PI3K蛋白的檢測(cè)在結(jié)腸癌的預(yù)后判斷方面具有非常重大的意義，有可能成為結(jié)腸癌診治新靶點(diǎn)。ADDINNE.Bib參考文獻(xiàn)[1] SiegelRL,MillerKD,FedewaSA,etal.Colorectalcancerstatistics,2017[J].CACancerJClin,2017,67(3):177-193.[2] ZuoT,LiJ,ZhangJ,etal.CoadministrationofchemotherapyandPI3K/Aktpathwaytreatmentwithmultistageacidity/CathBenzyme-responsivenanocarriersforinhibitingthemetastasisofbreastcancer[J].BiomaterSci,2019.[3] ShiN,YuH,ChenT.InhibitionofesophagealcancergrowththroughthesuppressionofPI3K/AKT/mTORsignalingpathway[J].OncoTargetsTher,2019,12:7637-7647.[4] ZhangD,ZhangP,LiL,etal.IrisinfunctionstoinhibitmalignantgrowthofhumanpancreaticcancercellsviadownregulationofthePI3K/AKTsignalingpathway[J].OncoTargetsTher,2019,12:7243-7249.[5] CaoP,WangY,LvY,etal.PI3Kp110alphainhibitionsensitizescervicalcancercellswithaberrantPI3KsignalingactivationtoPARPinhibitorBMN673[J].OncolRep,2019.[6] ChamcheuJC,RoyT,UddinMB,etal.RoleandTherapeuticTargetingofthePI3K/Akt/mTORSignalingPathwayinSkinCancer:AReviewofCurrentStatusandFutureTrendsonNaturalandSyntheticAgentsTherapy[J].Cells,2019,8(8).[7] DeSantisMC,GulluniF,CampaCC,etal.TargetingPI3Ksignalingincancer:Challengesandadvances[J].BiochimBiophysActaRevCancer,2019,1871(2):361-366.[8] JiangW,JiM.ReceptortyrosinekinasesinPI3Ksignaling:Thetherapeutictargetsincancer[J].SeminCancerB