H -J- 347.1-2018 水質(zhì) 糞大腸菌群的測定 濾膜法（正式版）（正式版）

中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)糞大腸菌群的測定濾膜法2018-12-26發(fā)布 1適用范圍 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 14方法原理 15干擾和消除 6試劑和材料 27儀器和設(shè)備 28樣品 39分析步驟 310結(jié)果計(jì)算與表示 411精密度和準(zhǔn)確度 512質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 513廢物處理 614注意事項(xiàng) 6附錄A(資料性附錄)糞大腸菌群檢驗(yàn)記錄及報(bào)告格式 7為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國水污染防治法》,保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中糞大腸菌群的測定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的濾膜法。本標(biāo)準(zhǔn)是對《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》(HJ/T347—2007)濾膜法部分的修訂。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布于2007年，原起草單位為中國環(huán)境監(jiān)測總站。本次為第一次修訂。本次修訂的主要內(nèi)容如下：——完善了方法原理的表述；——增加了檢出限；——增加了規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、干擾和消除、儀器和設(shè)備、樣品采集、樣品保存、精密度和準(zhǔn)確度、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制、廢物處理等章節(jié)；自本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施之日起，《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》(HJ/T347—2007)廢止。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省環(huán)境監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中心。本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：大連市環(huán)境監(jiān)測中心、丹東市環(huán)境監(jiān)測中心站、錦州市環(huán)境監(jiān)測中心站、遼陽市環(huán)境監(jiān)測站、鐵嶺市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站和沈陽市疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部2018年12月26日批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)自2019年6月1日起實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部解釋。1水質(zhì)糞大腸菌群的測定濾膜法1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中糞大腸菌群的濾膜法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測定。本方法的檢出限：當(dāng)接種量為100ml時，檢出限為10CFU/L;當(dāng)接種量為500ml時，檢出限為2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。又稱耐熱大腸菌群(thermotolerantcoliforms)。44.5℃培養(yǎng)24h,能在MFC選擇性培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，并形成藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落的腸桿菌科細(xì)菌。菌落形成單位colony-formingunits(CFU)單位體積樣品中的細(xì)菌群落總數(shù)。4方法原理樣品通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細(xì)菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養(yǎng)基上，在特定的溫度(44.5℃)下培養(yǎng)24h,膽鹽三號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，糞大腸菌群能生長并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色，通過顏色判斷是否產(chǎn)酸，并通過呈藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落計(jì)數(shù)，測定樣品中糞大腸菌群濃度。5干擾和消除5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時加入硫代硫酸鈉溶液(6.6)消除干擾。5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)2時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.7)消除干擾。6試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑或生物試劑，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離蛋白胨氯化鈉1%苯胺藍(lán)水溶液1%玫瑰紅酸溶液(溶于8.0g/L氫氧化鈉液中)10ml將上述培養(yǎng)基中的成分(除苯胺藍(lán)和玫瑰紅酸外),溶解于1000ml水中，調(diào)節(jié)pH至7.4,分裝于三角燒瓶內(nèi)，于115℃高壓蒸汽滅菌20min,儲存于冷暗處備用。臨用前，按上述配方比例，用滅菌吸管分別加入已煮沸滅菌的1%苯胺藍(lán)水溶液1ml及1%玫瑰紅酸溶液(溶于8.0g/L氫氧化鈉液中)1ml,混合均勻。如培養(yǎng)物中雜菌不多，則不加玫瑰紅酸亦可。加熱溶解前，加入1.2%～1.5%瓊脂可制成固體培養(yǎng)基。也可選用市售成品培養(yǎng)基。配制好的培養(yǎng)基避光、干燥保存，必要時在5℃±3℃冰箱中保存，分裝到平皿中的培養(yǎng)基可保存2～4周。配制好的培養(yǎng)基不能進(jìn)行多次融化操作，以少量勤配為宜。當(dāng)培養(yǎng)基顏色變化，或脫水明顯時應(yīng)廢棄不用。6.2無菌濾膜：直徑50mm,孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜，按無菌操作要求包扎，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，加入實(shí)驗(yàn)用水，煮沸滅菌3次，15min/次，前2次煮沸后需更換水洗滌2～3次。6.3無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min,備用。6.4硫代硫酸鈉(Na?S?O?5H?O)。6.5乙二胺四乙酸二鈉(C??H?N?O?Na?·2H?O)。稱取15.7g硫代硫酸鈉(6.4),溶于適量水中，定容至100ml,臨用現(xiàn)配。6.7乙二胺四乙酸二鈉溶液：p(CioH??N?O?Na?2H?O)=0.15g/ml稱取15g乙二胺四乙酸二鈉(6.5),溶于適量水中，定容至100ml,此溶液可保存30d。7儀器和設(shè)備7.1采樣瓶：1L、500ml或250ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。7.2高壓蒸汽滅菌器：115℃、121℃可調(diào)。7.3恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差44.5℃±0.5℃。7.4過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。7.6培養(yǎng)皿：直徑90mm。7.7一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。38樣品8.1樣品采集點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。樣品采集量可根據(jù)水體實(shí)際情況而定，一般不少于250ml。采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內(nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3～5min,然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對龍頭進(jìn)行消毒，開足龍頭，再放水1min,以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內(nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。如果采集的是含有活性氯樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.6),以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用(每125ml容積加入0.1ml的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.7),以消除干擾(每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。8.2樣品保存采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品在4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。9分析步驟9.1樣品過濾根據(jù)樣品的種類判斷接種量，最小過濾體積為10ml,如接種量小于10ml時應(yīng)逐級稀釋。先估計(jì)出適合在濾膜上計(jì)數(shù)所使用的體積，然后再取這個體積的1/10和10倍，分別過濾。理想的樣品接種量是濾膜上生長的糞大腸菌群菌落數(shù)為20～60個，總菌落數(shù)不得超過200個。當(dāng)最小過濾體積為10ml,濾膜上菌落密度仍過大時，則應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋。1:10稀釋的方法為：吸取10ml樣品，注入盛有90ml無菌水(6.3)的三角燒瓶中，混勻，制成1:10稀釋樣品。樣品接種量參考表見表1。用滅菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜(6.2)貼放在已滅菌的過濾裝置(7.4)上，固定好過濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾，以無菌水(6.3)沖洗器壁2～3次。樣品過濾完成后，再抽氣約5s,關(guān)上開關(guān)。9.2培養(yǎng)用滅菌鑷子夾取濾膜移放在MFC培養(yǎng)基(6.1)上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將培養(yǎng)皿倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。4表1樣品接種量參考表1▲▲▲湖泊(水庫)▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲處理后▲▲▲▲▲▲9.3對照試驗(yàn)每次試驗(yàn)都要用無菌水(6.3)按照步驟9.1和9.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測定。9.3.2陽性及陰性對照將糞大腸菌群的陽性菌株(如大腸埃希氏菌Escherichiacoli)和陰性菌株(如產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes)制成濃度為40～600CFU/L的菌懸液，分別按照步驟9.1和9.2培養(yǎng)，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。10結(jié)果計(jì)算與表示10.1結(jié)果判讀MFC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色的菌落為糞大腸菌群菌落，予以計(jì)數(shù)。MFC培養(yǎng)基上呈灰色、淡黃色或無色的菌落為非糞大腸菌群菌落，不予計(jì)數(shù)。結(jié)果判讀參考圖片見圖1。圖1結(jié)果判讀參考圖片5樣品中的糞大腸菌群數(shù)(CFU/L),按照式(1)進(jìn)行計(jì)算：證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為3670MPN/L,可接受范圍為330～7710MPN/L)進(jìn)行了6次重復(fù)測定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為5.3%～12%、0.81%～2.1%、0.51%～4.2%和7.7%～9.8%;實(shí)驗(yàn)室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.8%、3.9%、4.0%和3.6%;實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間見表2。表2實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間低濃度/(CFU/L)中濃度/(CFU/L)高濃度/(CFU/L)標(biāo)準(zhǔn)樣品/(CFU/L)95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間95%置信區(qū)間1.4×102~9.8×10?~2.6×10?8.2×10?~3.0×10?3.8×102~6個實(shí)驗(yàn)室對含糞大腸菌群濃度為3670MPN/L(可接受范圍為330～7710MPN/L)的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定：相對誤差范圍為-19%～-32%;相對誤差最終值為：-23%±10%。6的要求使濾膜上生長的菌落數(shù)為20～60個，然后按培養(yǎng)(9.2)的要求進(jìn)行操作，陽性菌株應(yīng)生長為藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落，陰性菌株應(yīng)生長為灰色、淡黃色、無色或無菌落生長。否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。12.2對照試驗(yàn)12.2.1空白對照每次試驗(yàn)都要用無菌水做實(shí)驗(yàn)室空白測定(9.3.1),培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上不得有任何菌落生長。否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。12.2.2陽性及陰性對照定期按照9.3.2進(jìn)行陽性及陰性對照試驗(yàn)，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反