氨基酸發(fā)酵模版

L-異亮氨酸的爭(zhēng)辯進(jìn)展Ehrlich1904年首次從甜菜糖漿中分別出來(lái),其化學(xué)組成雖與亮氨酸一樣,但理化性質(zhì)各異,故命名為異亮氨4種光學(xué)異構(gòu)體,L-異亮氨酸。,所以,8種氨基酸之20mg/kg(體重)L-異亮氨酸。L-異亮氨酸是合成人體激素、酶類的原料,具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制其分解的效果,在人體生命活動(dòng)中起著重要作用,因此,在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用及商業(yè)價(jià)值。食品方面,主要用于食品強(qiáng)化,使各種氨基酸平衡,提高食品的養(yǎng)分價(jià)值。在醫(yī)藥方(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)組成的復(fù)合氨基酸輸液以及大量用于配置治療型特種氨基酸的藥物,如肝安、肝靈口服液,對(duì)治療腦昏迷、肝昏迷、腎病等具有顯著療效,并可取代糖代謝而供給能量,是比較昂貴的氨基酸原料藥之一。近年來(lái)的爭(zhēng)辯說(shuō)明,L-B2防范素表達(dá)的誘導(dǎo)物,在誘導(dǎo)上皮防范素表達(dá)上起著重要作用,作為一種免疫刺激物,對(duì)粘膜外表的防L-L-纈氨酸凝膠具有帶正電的端基,是型低分子量凝膠,不僅可以使純水和含有無(wú)機(jī)酸和鹽的水溶液成凝膠而且可以使有機(jī)溶劑和油成膠狀,可以制備形成水凝膠,其在生物醫(yī)藥、組織工程、光化學(xué)、電化學(xué)、食品工業(yè)、化裝品等領(lǐng)域已被廣泛運(yùn)用。在國(guó)外,還將其大量用于乳牛催乳以及飼料添加劑,L-異亮氨酸添加到飲料中生產(chǎn)功能飲料等。1L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法過(guò)去氨基酸都是以酸水解蛋白質(zhì)制造,1956年日本協(xié)和發(fā)酵公司用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸以后,氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)展很快,到目前為止,絕大多數(shù)氨基酸已能L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法由于原料來(lái)源受限制,生產(chǎn)本錢高,污染環(huán)境,難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)L-異亮氨酸具有原料本錢低,反響條件溫存,簡(jiǎn)潔實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),L-異亮氨酸最主要的方法。L-異亮氨酸發(fā)酵有添加前體發(fā)酵(又稱微生物轉(zhuǎn)化法)和直接發(fā)酵-種方法。早期,異亮氨酸發(fā)酵是利用芽孢桿菌(Bacillus)、沙雷氏菌(Serrati)、假單孢菌(Pseudomonas)等使用葡A-A-羧基丁酸、D-A-酮基異戊酸等,以避開(kāi)氨基酸合成途徑的反響抑制,經(jīng)微生物作用將力量,通過(guò)菌株的誘變處理,選育出各種養(yǎng)分缺陷型和氨基酸構(gòu)造類似物抗性突變株,如黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒桿菌、、鈍齒棒桿菌等,以解除代謝調(diào)L-異亮氨酸的目的。2L-異亮氨酸的生物合成途徑及調(diào)整L-異亮氨酸的生物合成途徑,,其1所示。L-異亮氨酸的生物合成及代謝調(diào)控異亮氨酸生物合成的根本調(diào)整機(jī)制有反響把握和在合成途徑分枝點(diǎn)處的,5個(gè)關(guān)鍵酶把握其強(qiáng)度,它們分別受不同的代謝產(chǎn)物的反響調(diào)整,活化這些酶有利于異亮氨酸的生物合成。(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC,EC41111138)1酶,抑制,受天冬氨酸、谷氨酸的反響阻遏,CoA、GDP、GTP或二磷酸果糖所激活。(2)天冬氨酸激酶(AK,E1C12171214)AK受蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反響抑制。通過(guò)選育賴氨酸養(yǎng)分缺陷型切斷由天冬氨酸半醛向賴氨酸的合成途徑,使代謝流更加暢通,積存中間代謝物蘇氨酸,L-異亮氨酸積存。(3)高絲氨酸脫氫酶(HD,EC1111113)(AHV、ThrHx)抗性突變株、蛋氨酸構(gòu)造類似物(Eth)抗性變株或者蛋氨酸缺陷型可活化該酶。(4)蘇氨酸脫氨酶(TD,E1C141211116)1個(gè)限速酶,受異亮氨酸的反響抑制。篩選異亮氨酸構(gòu)造類似物如乙硫氨酸(Eth)、異亮氨酸氧肟酸(IleHx)、纈氨酸構(gòu)造脫氨酶的反響抑制,L-異亮氨酸。(5)乙酰羥酸合成酶(AS,E1C141113118)AS是異亮氨酸合成途徑的第-個(gè)限速酶,A-氨基丁酸(A-AB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)等抗性突變株來(lái)活化該酶。L-異亮氨酸過(guò)程中,谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成,谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)積存到肯定濃度后,反響抑制谷氨酸脫氫酶,使細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)向天L-異亮氨酸過(guò)程中,蛋氨酸優(yōu)先合成,蛋氨酸過(guò)剩合成異亮氨酸的初始酶天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反響抑制,因此切斷向賴氨酸的合成途徑,可以積存中間代謝物蘇氨酸,L-異亮氨酸積存濃度增加。異亮氨酸的代謝調(diào)控育種代謝調(diào)控育種機(jī)理異亮氨酸發(fā)酵過(guò)程是典型的代謝把握發(fā)酵,代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)整機(jī)制,選擇奇異的技術(shù)路線,通過(guò)遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過(guò)微生物正常代謝的突變株,從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量合成和積存。蘇氨酸是異亮氨酸的前體物,設(shè)法解除對(duì)蘇氨酸生物合成的反響把握,增加蘇氨酸的生物合成,,通過(guò)切斷支路代謝選育養(yǎng)分缺陷型突變菌株,或通過(guò)解除反響調(diào)整選育構(gòu)造類似物抗性突變株,均可提高產(chǎn)生菌積存異亮氨酸的力量。例如,蛋氨酸是異亮氨酸合成支路的代謝物,比蘇氨酸優(yōu)先合成,即蛋氨酸合成過(guò)量后才能使代謝流轉(zhuǎn)向合成蘇氨酸,進(jìn)一L-異亮氨酸。選育蛋氨酸養(yǎng)分缺陷型可切斷合成蛋氨酸的支路,提高菌株A-氨基-B羥基戊酸(AHV)、L-異亮氨酸代謝過(guò)程中的反響抑制,L-異亮氨酸的積存。誘變選育為動(dòng)身菌株,經(jīng)亞硝基胍(NTG)誘變,獲得為動(dòng)身菌株,經(jīng)硫酸二乙酯(DES)、NTG和紫外線(UV)復(fù)合誘變處理,定向篩選,1L-ZQ24,經(jīng)搖瓶發(fā)酵,產(chǎn)量可達(dá)DES誘變,定向選育具ISW330,獲得搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-11g/LL-蘇氨酸FAB-3-1為親株,選育乙硫氨酸(Eth)抗性突變株,L-蘇Eth可以解TD的反響抑制,促進(jìn)異亮氨酸的積存。生物工程菌勝亦等用大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌的穿梭載體,以野生型谷氨T106DNA為供體,T106的高絲氨酸缺陷株SaDNA片段,pCHom17,將它導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中分別出異氨酸操縱子,PBR3--中,將重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到異亮,WSI-99,異亮氨酸可積存-8g/L。小野將異亮氨酸操縱子克隆,然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)展體外羥胺誘變,將處理后的重組質(zhì)C600,獲得帶有異亮氨酸氧肟酸抗性的工程,異亮氨酸產(chǎn)量可中克隆編碼蘇氨酸脫水酶基因,得到攜帶抗反響蘇氨酸脫水酶的突變,使同基因的ClglutamicumL-異亮氨酸,L-30g/L。S1GuillouetpAPE20,表達(dá)蘇氨酸,使碳流向異亮氨酸合成的方向,4L發(fā)酵罐中異亮氨酸最高產(chǎn)量可達(dá)40g/L。L-異亮氨酸發(fā)酵的工藝把握代謝把握育種和發(fā)酵過(guò)程的代謝過(guò)程培育是實(shí)現(xiàn)代謝把握發(fā)酵的兩個(gè)重要手段。培育基發(fā)酵培育基的成分和配比是打算菌體代謝的主要因素,對(duì)異亮氨酸的產(chǎn)量及,糖蜜、A-溴丁酸等也可作為碳源。A-氨基丁酸、A-羧基丁酸、DL-蘇氨酸、A-酮丁酸常作為發(fā)酵前體物。氮源一般以硫酸銨、尿素等為無(wú)機(jī)氮源;玉米漿、豆餅水解液等作為有機(jī)氮源。異亮氨酸產(chǎn)生菌大都是生物素缺陷型,因此,有機(jī)氮源也,是異亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵。在異亮氨酸生產(chǎn)中,承受尿素或者氨水為氮,pHATP等進(jìn)展能量轉(zhuǎn)化和合成菌體的作用,強(qiáng)化電子傳遞系統(tǒng),NAD(P)H生成和消耗更快,有利于代謝流轉(zhuǎn)化,把握適量的磷酸鹽有利于產(chǎn)酸。金屬離子如鎂離子、錳離子和鉀離子是作為某些酶的激活劑;鐵離子是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶的活性基的組成成分;鈉離子則在培育基中起調(diào)整滲透壓的作用,因此適量濃度的金屬離子在異亮氨酸生物生產(chǎn)中有著重要的作用。pH值和溫度的影響pH值有流加尿、25%、28%。氨調(diào)pH值作用快,但不宜把握。流加尿素要求少量屢次,pH值比較穩(wěn)定。發(fā)酵前pH值不能超L-異亮氨酸發(fā)酵屬于生長(zhǎng)局部耦聯(lián)型,菌體生長(zhǎng)到達(dá)肯定程度后才開(kāi)頭產(chǎn)生異亮氨酸,因此菌體生長(zhǎng)最適溫度異亮氨酸合成最適溫度是不同的。許正宏等提出了變溫把握理論,31e,可以有效的縮短菌體生長(zhǎng)的遲滯期,有利于L-異亮氨酸合成酶系活性較強(qiáng),L-異亮氨酸的合成并削減其它雜氨基酸的形成。溶氧與發(fā)酵的關(guān)系發(fā)酵過(guò)程中溶氧由通氣量、轉(zhuǎn)速、罐分壓打算,氧飽和度一般把握在10%~30%。L-異亮氨酸發(fā)酵是處于一類(供氧充分的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵)和三類(在缺氧條件下進(jìn)展的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵)發(fā)酵之間的二類發(fā)KLA值覺(jué)察,KLA使發(fā)酵中后期代謝流發(fā)生遷移,產(chǎn)生副產(chǎn)物如丙氨酸、谷氨酸等雜酸;KLA過(guò)低時(shí),產(chǎn)生纈氨酸等雜酸,L-異亮氨酸產(chǎn)量低,同時(shí)產(chǎn)生有,L-異亮氨酸碳骨架由丙酮酸供給,TCA和He-TPP兩個(gè)途徑,前者要求溶氧高,后者要求溶氧盡量低一些,因此,承受分階段L-異亮氨酸的大量積存。補(bǔ)料L-異亮氨酸發(fā)酵模式中有分批式、流加式、半連續(xù)式,其中流加模式應(yīng)用較多。流加式發(fā)酵,即補(bǔ)料-分批發(fā)酵,需在分批發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入穎的料液如葡葡萄糖對(duì)菌體生長(zhǎng)起抑制作用,且滅菌時(shí)葡萄糖易被破壞生成有害物質(zhì),因此,發(fā)酵過(guò)程中要補(bǔ)加葡萄糖。浦軍公平報(bào)道,L-異亮氨酸發(fā)酵初糖濃度把握在1%的糖,30tL-異亮氨酸產(chǎn)L-異亮氨酸的產(chǎn)生,使磷酸鹽大量消耗而濃度降低,因此在發(fā)酵中要補(bǔ)加磷酸鹽,使其維持肯定的濃度。6國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)現(xiàn)狀國(guó)際上氨基酸生產(chǎn)廠家主要有日本味之素、協(xié)和發(fā)酵、田邊制藥以及德國(guó)4家公司,L-異亮氨酸產(chǎn)量、品質(zhì)和技術(shù)左右,70%。日本60%的市場(chǎng)份額,味之素公司巴西分公司也將于-006,菌株產(chǎn)產(chǎn)水平和生產(chǎn)設(shè)備遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于日本等國(guó),產(chǎn)量不能滿足市場(chǎng)需求。19