水質(zhì) 浮游植物的測定 濾膜法（征求意見稿）

目次

前言...............................................................................................................................................ii

1適用范圍.......................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...........................................................................................................................1

3術(shù)語和定義...................................................................................................................................1

4方法原理.......................................................................................................................................1

5試劑和材料...................................................................................................................................2

6儀器和設(shè)備...................................................................................................................................2

7樣品...............................................................................................................................................3

8分析步驟.......................................................................................................................................4

9結(jié)果計(jì)算與表示...........................................................................................................................6

10精密度.........................................................................................................................................6

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制.................................................................................................................7

附錄A（規(guī)范性附錄）濾膜法檢出限.......................................................................................8

附錄B（資料性附錄）顯微鏡校準(zhǔn)...........................................................................................9

附錄C（資料性附錄）絲狀體、似球形群體浮游植物細(xì)胞數(shù)估算.....................................11

i

前言

為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國水污染防治法》，保護(hù)生態(tài)

環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中浮游植物的測定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定地表水中浮游植物的濾膜法。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B～附錄C為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。

本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江省環(huán)境監(jiān)測中心。

本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：上海市環(huán)境監(jiān)測中心、浙江省海洋監(jiān)測預(yù)報(bào)中心、杭州市環(huán)境監(jiān)測中

心站、寧波市環(huán)境監(jiān)測中心、江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心和自然資源部第二海洋研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部20□□年□□月□□日批準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)自20□□年□□月□□日起實(shí)施。

本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部解釋。

ii

水質(zhì)浮游植物的測定濾膜法

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中浮游植物的濾膜法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水中浮游植物的快速測定。

當(dāng)樣品最大過濾體積1000ml時(shí)，方法定量檢出限為40cells/L。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水或?qū)嶒?yàn)方法

HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

浮游植物phytoplankton

在水中營浮游生活的藻類植物，通常浮游植物就是浮游藻類，包括原核的藍(lán)藻門和其它

各類真核藻類。

3.2

浮游植物密度Densityofphytoplankton

單位體積的浮游植物細(xì)胞數(shù)或個(gè)體數(shù)，cells/ml或個(gè)體/ml。

3.3

計(jì)數(shù)單位countingunit

顯微鏡視野下可計(jì)數(shù)的最小單元，細(xì)胞或個(gè)體。

3.4

自然單位naturalunitcount

浮游植物在自然狀態(tài)下的存在形式，如單細(xì)胞，絲狀體或似球形群體。

3.5

顯微鏡計(jì)數(shù)視野microscopecountingfield

顯微鏡視野中一定面積的計(jì)數(shù)區(qū)域。

4方法原理

樣品通過一定孔徑的濾膜，群體、絲狀體及單細(xì)胞浮游植物截留在濾膜上，濾膜經(jīng)透明

處理后在顯微鏡下鏡檢，對浮游植物進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1

5試劑和材料

除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子

水或蒸餾水。

5.1碘化鉀（KI）。

5.2碘（I2）。

5.3市售甲醛：ρ（HCHO）＝37%。

5.4魯哥氏液（Lugolssolution）

稱取60g碘化鉀（5.1）溶解在1000ml水中，再加入40g碘（5.2），充分?jǐn)嚢枋蛊淙?/p>

解，靜置24h以上。當(dāng)溶液接近飽和時(shí)會(huì)有沉淀出現(xiàn)，使用前需去除沉淀。魯哥氏液在室

溫避光條件下可保存1年。

2323

5.5市售透明油：包括顯微鏡浸沒油（nD=1.515或ne=1.518）和透明玻璃滴棒。

5.6濾膜：微孔混合纖維素酯膜（Mixtedester/cellusoseesterFilters），直徑25mm，孔徑

0.45μm～3μm。

按以下方法對每批次濾膜進(jìn)行水化測試和油透明測試，達(dá)到要求后方可使用。

（1）將一張未使用的濾膜放入盛水的燒杯中，若濾膜被水完全浸透，則濾膜可水化。

（2）另取一張未使用的濾膜，置于滴有顯微鏡浸沒油的載玻片上，若濾膜被浸沒油完全浸

潤，則濾膜可透明。

6儀器和設(shè)備

6.1正置或倒置顯微鏡：物鏡4×、10×、20×、40×；目鏡10×。

6.2真空泵：17kPa壓力以下可調(diào)。

6.3烘箱：70℃±2℃可調(diào)。

6.4微孔濾膜過濾器：包括漏斗（直徑25mm，容量200ml）、多孔聚酯濾膜支撐板、收

集瓶。

6.5蓋玻片：25mm×25mm。

6.6載玻片：25mm×76mm。

注：載玻片和蓋玻片使用前需用濃鹽酸和乙醇浸泡。若條件允許，可選擇耐潔載玻片或蓋玻片。

6.7目鏡分劃板：WHIPPLEGRID。

6.81mm鏡臺(tái)測微尺。

6.9涼片板。

6.10無齒扁咀鑷子。

6.1125號浮游生物網(wǎng)：網(wǎng)孔直徑為0.064mm，網(wǎng)呈圓錐形，網(wǎng)口套在銅環(huán)上，網(wǎng)底端有

出水開關(guān)活塞。

6.121L～2L樣品瓶、50ml樣品瓶，材質(zhì)為玻璃、聚丙烯或聚乙烯。

6.13冷藏采樣箱：2℃～8℃。

6.14一般實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備：包括去離子水設(shè)備，不同規(guī)格量筒，移液管，移液槍，燒杯，

玻璃攪拌棒等。

2

7樣品

7.1樣品的采集

浮游植物樣品采集點(diǎn)位設(shè)置參照HJ/T91等的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。若湖泊、水庫水體是圓形

或接近圓形的，應(yīng)從此岸至彼岸至少設(shè)兩個(gè)互相垂直的采樣斷面；若是狹長的區(qū)域，至少應(yīng)

設(shè)三個(gè)互相平行、間隔均勻的斷面。河流水體：在一個(gè)采樣斷面上，水面寬小于50米時(shí)，

只設(shè)中泓1條垂線；水面寬50米～100米時(shí)，在左、右岸有明顯水流處設(shè)2條垂線；水面

寬大于100米時(shí)，在左、中、右設(shè)三條垂線。

浮游植物在水體中不僅水平上有差異，而且垂直分布也有不同。一般情況下，當(dāng)湖泊、

水庫水深不足1米時(shí)，可在1/2水深處采樣；當(dāng)湖泊、水庫水深不超過2m時(shí)，可在表層下

0.5m處采樣，若水體透明度很低，可在底層加采一個(gè)樣品與表層樣品合成混合樣；若水體

超過2m時(shí)、透明度較大，可按表層、透明度的0.5倍、1倍、2.5倍和3倍處各取一個(gè)樣品，

將各層樣品混合均勻，再從混合樣品中取樣作為定量樣品；也可在有光層內(nèi)按3m~6m（或

更大間距）進(jìn)行等間距采樣。分層層數(shù)與監(jiān)測目的有關(guān)，分層越密，獲取的信息越詳細(xì)。一

般情況下，河流可不分層采樣，直接在水面下0.5m處采樣，或在下層（河底上0.5m）加采

一個(gè)樣品，兩次混合即可。若需了解浮游生物垂直分布狀況，不同層次分別采樣后，不需混

合。

有些浮游植物（如藍(lán)藻）常上浮在水面或有成片、成帶分布的情況，采樣時(shí)應(yīng)加以注意。

應(yīng)盡量保持在每天的相近時(shí)間采樣，如上午8點(diǎn)～10點(diǎn)時(shí)。

7.1.1定性樣品

使用25號浮游生物網(wǎng)（6.1）采集定性樣品。關(guān)閉浮游生物網(wǎng)底端出水開關(guān)活塞，在水

面表層至0.5m水深處以20cm/s～30cm/s的速度做“∞”形往復(fù)緩慢拖動(dòng)約1~3min，也

可沿表層至0.5m水深出緩慢拖動(dòng)，濾過1.5m3～5.0m3體積的水體。將浮游生物網(wǎng)提出水

面，水體自然通過網(wǎng)孔，待底部還剩少許水體（5ml～10ml）時(shí)，將底端出口伸入采樣瓶

（6.2）中，打開底端活塞收集定性樣品。

7.1.2定量樣品

采集1L～2L水至樣品瓶（6.12）中，立刻加入10ml魯哥氏液（5.4）固定，若浮游植

物密度過低，應(yīng)酌情增加采水量。樣品瓶也可提前加好魯哥氏液（5.4）帶至現(xiàn)場。

注意：樣品采集完成后，樣品瓶中樣品液面至瓶蓋應(yīng)留有一定空間，便于樣品混勻。

7.2樣品的保存

7.2.1定性樣品

定性樣品應(yīng)避光保存在4℃～10℃環(huán)境條件下，保存時(shí)間不超過36h。高溫環(huán)境下采

集的定性樣品在保存前需逐漸降溫，避免溫度變化過快對浮游植物細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

7.2.2定量樣品

3

每1000ml定量樣品中加入15ml魯哥氏液（5.4）。室溫避光條件下可保存3周；1℃～

5℃冷藏避光條件下可保存12個(gè)月。

樣品在保存過程中，應(yīng)每周檢查魯哥氏液的氧化程度，如果樣品顏色變淺，則應(yīng)向樣品

中補(bǔ)加適量的魯哥氏液，直至樣品顏色恢復(fù)為黃褐色。

若定量或定性樣品含大量有機(jī)質(zhì)、需儲(chǔ)存12個(gè)月以上時(shí)，應(yīng)加入甲醛溶液（5.3）固定，

每100ml樣品加4ml甲醛溶液（5.3）。

8分析步驟

8.1試樣制備

8.1.1預(yù)檢

完成預(yù)檢裝片（8.1.2～8.1.5），判斷樣品浮游植物密度（8.2.2），以便于樣品的后續(xù)分析。

8.1.2樣品搖勻

樣品過濾前，將樣品瓶水平轉(zhuǎn)動(dòng)、垂直顛倒至少30s，充分混勻，混勻動(dòng)作要輕且速度

均勻。

8.1.3過濾體積

樣品浮游植物密度在108cells/L以上時(shí)，樣品過濾體積0.5ml～2ml；樣品浮游植物密

度在107cells/L數(shù)量水平時(shí)，樣品過濾體積5ml～10ml；樣品浮游植物密度在106cells/L數(shù)

量水平時(shí)，樣品過濾體積5ml～25ml；樣品浮游植物密度在105cells/L數(shù)量水平時(shí)，樣品

過濾體積10ml～50ml。當(dāng)樣品過濾體積小于5ml時(shí)，用實(shí)驗(yàn)用水將樣品再懸浮，最后在

懸浮樣品中加幾滴魯哥氏固定液（5.4）。

注1：當(dāng)樣品過濾體積大于漏斗容量時(shí)，需保證后續(xù)樣品加入不擾動(dòng)濾膜上的浮游植物。

8.1.4樣品過濾

用量筒、定量移液器或移液槍（6.14）定量量取樣品體積，將樣品加入微孔濾膜過濾器

（6.4）漏斗中，靜止2min～3min，使用真空泵（6.2）抽濾，控制真空壓力不高于17kPa

（5inHg），抽濾至漏斗中有0.5cm液層時(shí)關(guān)掉真空泵，使剩余液體完全通過漏斗。切忌抽

干濾膜，抽濾過程一次完成，不建議后續(xù)加入樣品，以免影響濾膜上浮游植物的分布。

注：當(dāng)樣品過濾體積大于漏斗容量時(shí)，需保證后續(xù)樣品加入不擾動(dòng)濾膜上的浮游植物。

8.1.5裝片制備

樣品過濾完成后，用無齒扁咀鑷子（6.10）取下濾膜，保持有藻面朝上，放在滴有2滴

顯微鏡浸沒油（5.5）的載玻片（6.6）上，再用透明玻璃滴棒（5.5）在濾膜上滴2滴顯微鏡

浸沒油（5.5），將載玻片（6.6）放入涼片板（6.9），置于烘箱（6.3）中，70℃±2℃加熱

2h。2h后取出涼片板（6.9），觀察濾膜是否透明。若已透明，再在濾膜上滴2滴顯微鏡浸

沒油（5.5），蓋上蓋玻片（6.5），裝片制備完畢。若濾膜加熱2h后未透明，可延長加熱時(shí)

4

間，建議不超過24h。加蓋蓋玻片（6.5）時(shí)，勿擾動(dòng)濾膜。

8.2顯微計(jì)數(shù)

8.2.1顯微鏡標(biāo)定

計(jì)數(shù)前標(biāo)定顯微鏡（6.1），確定計(jì)數(shù)視野面積（Whipple視野或目鏡視場視野）。顯微鏡

標(biāo)定設(shè)備包括Whipple目鏡分化板（6.7）和1mm鏡臺(tái)測微尺（6.8）。Whipple目鏡分劃板

標(biāo)定詳見資料性附錄B。

8.2.2計(jì)數(shù)

裝片（8.1.5）置于顯微鏡（6.1）載物臺(tái)上，用whipple視野法或目鏡視場視野法進(jìn)行鏡

檢計(jì)數(shù)，記錄每個(gè)視野的浮游植物種類及數(shù)量。根據(jù)藻細(xì)胞大小，選擇200x、400x放大倍

數(shù)對藻類進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

whipple視野法計(jì)數(shù)規(guī)則：視野中處于下邊界及右邊界線的藻類計(jì)入總數(shù)（Y），處于上

邊界及左邊界線的藻類不計(jì)入總數(shù)（N）；從里到外，計(jì)數(shù)每一個(gè)接觸計(jì)數(shù)邊界的藻類，忽

略每一個(gè)接觸非計(jì)數(shù)邊界的藻類，詳見圖1。若出現(xiàn)絲狀體等較大個(gè)體顯著穿過兩個(gè)或多個(gè)

格子的邊界時(shí)，需在低倍鏡下單獨(dú)計(jì)數(shù)，再計(jì)入總數(shù)。絲狀體或似球形群體細(xì)胞數(shù)估算詳見

資料性附錄C。計(jì)數(shù)時(shí)，緩慢移動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)，確保濾膜上、下、左、右和中部區(qū)域的視

野均有抽樣。顯微鏡視野在濾膜上的移動(dòng)示例詳見圖2，需避免在一個(gè)區(qū)域重復(fù)抽樣。

較低密度樣品計(jì)數(shù)時(shí)，建議選擇目鏡視場視野法。不同樣品推薦視野類別及計(jì)數(shù)視野數(shù)

詳見表1。

注：Y為計(jì)數(shù)在內(nèi)，N為不計(jì)數(shù)在內(nèi)。

圖1浮游植物計(jì)數(shù)約定規(guī)則

5

圖2顯微鏡視野在濾膜上的移動(dòng)示例

表1不同樣品推薦視野類別及計(jì)數(shù)視野數(shù)

樣品推薦計(jì)數(shù)視野類別推薦計(jì)數(shù)視野數(shù)

高密度樣品（108cells/L及以上）Whipple視野大于10個(gè)

中密度樣品（106cells/L～107cells/L）Whipple視野大于20個(gè)

低密度樣品（106cells/L以下）目鏡視場視野大于20個(gè)

9結(jié)果計(jì)算與表示

9.1結(jié)果計(jì)算

樣品的浮游植物個(gè)體數(shù)或細(xì)胞數(shù)N依據(jù)公式（1）計(jì)算。

CAt

N=1000（1）

AcV

式中：N——每升樣品中浮游植物個(gè)體數(shù)或細(xì)胞數(shù)；

C——計(jì)數(shù)的浮游植物個(gè)體數(shù)或細(xì)胞數(shù)；

2

At——濾膜有效面積（有效過濾面積），mm；

2

Ac——計(jì)數(shù)面積（鏡檢計(jì)數(shù)的視野面積之和），mm；

V——樣品的過濾體積，ml。

9.2結(jié)果表示

測定結(jié)果以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，保留兩位有效數(shù)字。

10精密度

6家實(shí)驗(yàn)室分別對含高密度（1.0×108cells/L）、中密度（4.02×106cells/L）和低密度（6.95

×104cells/L）的浮游植物樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.18%～

0.64%，0.22%～0.49%，0.37%～1.16%；實(shí)驗(yàn)室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：0.28%，0.68%，1.57%。

計(jì)算精密度所用數(shù)據(jù)均經(jīng)以10為底對數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。高、中、低密度驗(yàn)證樣品的實(shí)驗(yàn)室間95%

置信區(qū)間見表2。

表2高、中、低密度驗(yàn)證樣品的實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間

高密度樣品（cells/L）中密度樣品（cells/L）低密度樣品（cells/L）

均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間

9.79×1079.29×107～1.03×1084.02×1063.62×106～4.43×1066.95×1045.72×104～8.18×104

6

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

11.1最小計(jì)數(shù)量。一般情況下，浮游植物種類的計(jì)數(shù)誤差可設(shè)定±20%，優(yōu)勢種種類計(jì)數(shù)

最少100～150個(gè)。要達(dá)到10%的計(jì)數(shù)誤差，需增加4倍的計(jì)數(shù)量。計(jì)數(shù)誤差應(yīng)指明是針對

浮游植物總分類單元，還是針對某一種類。

11.2每批次樣品中，隨機(jī)抽取10%的樣品做平行雙樣測定，計(jì)算計(jì)數(shù)差異百分比（PDE），

浮游植物總密度的PDE因項(xiàng)目要求而定。PDE按式（2）計(jì)算，公式（2）中Lab1和Lab2

分別代表平行雙樣的檢測結(jié)果。

lab?lab

PDE=12100%（2）

lab12+lab

11.3定期校準(zhǔn)顯微鏡，標(biāo)定目鏡分劃板及視野面積，一年至少一次。

11.4每批次濾膜作延展性測試，要求濾膜透明處理前后直徑變化在1.0mm以內(nèi)。

11.5從事浮游植物鑒定的技術(shù)人員需定期參加專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)。定期開展人員或?qū)嶒?yàn)室間比

對，比對數(shù)據(jù)結(jié)果分析參照11.2。

7

附錄A

（規(guī)范性附錄）

濾膜法檢出限

附錄A給出了濾膜法檢出限計(jì)算方法。濾膜法檢出限與計(jì)數(shù)視野數(shù)、可計(jì)數(shù)視野總數(shù)

及子樣本體積有關(guān)。假設(shè)樣品在濾膜上符合隨機(jī)分布，可通過泊松統(tǒng)計(jì)來確定其定量檢測限

MDL。MDL計(jì)算公式見下式。

-lnα×n

MDL=total

Vncounted

式中：

MDL—置信水平α的方法檢出限，單位：個(gè)/升或細(xì)胞數(shù)/升；

α—置信水平，一般選擇置信水平0.01或0.05；

ncounted—參與計(jì)數(shù)的視野數(shù)，個(gè)；

ntotal—可用于觀察的計(jì)數(shù)視野總數(shù)，個(gè)；

V—樣品過濾體積，L。

8

附錄B

（資料性附錄）

顯微鏡校準(zhǔn)

B.1目鏡分劃板

標(biāo)定目鏡分劃板，以計(jì)算不同放大倍數(shù)下的計(jì)數(shù)視野面積。whipplegrid是一種網(wǎng)格型

目鏡分劃板，外觀為刻有方格的玻璃圓盤，包含一個(gè)大格，大格被均分成100中格，其中心

位置處格子又被均分成25個(gè)小格。Whipplegrid分劃板詳見圖B.1。使用臺(tái)測微尺標(biāo)定

Whipplegird分劃板。鏡臺(tái)測微尺規(guī)格為1mm，均分成100等分，每分格代表10μm，臺(tái)測

微尺詳見圖B.2。

圖B.1目鏡測微尺100div

圖B.2臺(tái)測微尺0.01mm/100Div

B.2Whipplegrid標(biāo)定步驟

B.2.1將whipplegrid刻度朝下裝入目鏡隔板上；

B.2.2將臺(tái)測微尺放在顯微鏡載物臺(tái)上，刻度朝上。先低倍對焦，使視野中臺(tái)測微尺刻度清

晰；

B.2.3轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使whipplegrid與鏡臺(tái)測微尺刻度平行，移動(dòng)載物臺(tái)至兩尺重疊，再使兩

尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度

之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)。臺(tái)測微尺每格長度10μm，在一定放大倍數(shù)下，

目鏡測微尺的標(biāo)定結(jié)果即每格的長度：

9

目鏡測微尺每格長度=（臺(tái)測微尺n格×臺(tái)測微尺每格長度）/與臺(tái)測微尺重合的目鏡測微尺

格數(shù)，將數(shù)據(jù)填入表B.1。依據(jù)表B.1完成表B.2。

表B.1Whipplegrid目鏡分劃板標(biāo)定結(jié)果

目鏡&物鏡組合次數(shù)n大格/mm均值中格/μm均值

1

10X&10X2

3

1

10X&20X2

3

1

10X&40X2

3

1

10X&4X2

3

表B.2Whipplegrid面積計(jì)算結(jié)果

目鏡&物鏡組合次數(shù)nWhipplegrid面積/mm2均值

1

10X&10X2

3

1

10X&20X2

3

1

10X&40X2

3

1

10X&4X2

3

10

附錄C

（資料性附錄）

絲狀體、似球形群體浮游植物細(xì)胞數(shù)估算

C.1絲狀體細(xì)胞數(shù)估算

取多個(gè)藻絲體的多次平均值或者中位數(shù)作為絲狀體的平均細(xì)胞數(shù)。一般選擇計(jì)數(shù)30個(gè)

絲狀體，通過分析30個(gè)絲狀體的細(xì)胞數(shù)分布，若呈正態(tài)分布，絲狀體總細(xì)胞數(shù)=平均值×絲

狀體數(shù)目；若呈偏態(tài)分布，絲狀體總細(xì)胞數(shù)=中值×絲狀體數(shù)目（GertraudH?tzelandRoger

Croome,1990）。

C.2似球形群體細(xì)胞數(shù)估算

通過群體直徑估算似球形群體細(xì)胞數(shù)，估算公式見式（1）。

log10y=2.99log10x-2.80…………（1）

式中：y——細(xì)胞數(shù)；

x——平均群體直徑，μm。

使用該公式對微囊藻群體估算細(xì)胞數(shù)時(shí)需滿足：似球形群體體積測量時(shí)，需忽略群體的

表層膠被，群體直徑為充滿細(xì)胞部分的直徑；將非球形群體視為圓柱體、卵圓體估算群體體

積；最后計(jì)算時(shí)，平均群體直徑為等同于群體平均體積的球形群體的直徑，需隨機(jī)測量至少

30個(gè)群體，以獲得合理的群體平均體積（ReynoldsandJaworski,1978）。

似球形群體細(xì)胞數(shù)估算也可按照絲狀體細(xì)胞數(shù)的確定方法，確定似球形群體的細(xì)胞數(shù)。

或者，還可以確定要測定的每一個(gè)群體的細(xì)胞數(shù)，而不是估計(jì)一定大小平均細(xì)胞數(shù)。對于特

別大的群體，可以通過目鏡分劃板計(jì)數(shù)群體的一小部分面積的細(xì)胞數(shù)，然后估計(jì)整個(gè)群體中

相似面積的總細(xì)胞數(shù)。當(dāng)然這是粗略計(jì)數(shù)而非精確計(jì)數(shù)，使用這種方法需要在工作記錄表上

說明（GertraudH?tzelandRogerCroome,1990）。

11

中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)

HJ□□□-20□□

水質(zhì)浮游植物的測定濾膜法

Waterquality—DeterminationofPhytoplankton—Membranefiltration

method

（征求意見稿）

水質(zhì)浮游植物的測定濾膜法

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中浮游植物的濾膜法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水中浮游植物的快速測定。

當(dāng)樣品最大過濾體積1000ml時(shí)，方法定量檢出限為40cells/L。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水或?qū)嶒?yàn)方法

HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

浮游植物phytoplankton

在水中營浮游生活的藻類植物，通常浮游植物就是浮游藻類，包括原核的藍(lán)藻門和其它

各類真核藻類。

3.2

浮游植物密度Densityofphytoplankton

單位體積的浮游植物細(xì)胞數(shù)或個(gè)體數(shù)，cells/ml或個(gè)體/ml。

3.3

計(jì)數(shù)單位countingunit

顯微鏡視野下可計(jì)數(shù)的最小單元，細(xì)胞或個(gè)體。

3.4

自然單位naturalunitcount

浮游植物在自然狀態(tài)下的存在形式，如單細(xì)胞，絲狀體或似球形群體。

3.5

顯微鏡計(jì)數(shù)視野microscopecountingfield

顯微鏡視野中一定面積的計(jì)數(shù)區(qū)域。

4方法原理

樣品通過一定孔徑的濾膜，群體、絲狀體及單細(xì)胞浮游植物截留在濾膜上，濾膜經(jīng)透明

處理后在顯微鏡下鏡檢，對浮游植物進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1

5試劑和材料

除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水為新制備的去離子

水或蒸餾水。

5.1碘化鉀（KI）。

5.2碘（I2）。

5.3市售甲醛：ρ（HCHO）＝37%。

5.4魯哥氏液（Lugolssolution）

稱取60g碘化鉀（5.1）溶解在1000ml水中，再加入40g碘（5.2），充分?jǐn)嚢枋蛊淙?/p>

解，靜置24h以上。當(dāng)溶液接近飽和時(shí)會(huì)有沉淀出現(xiàn)，使用前需去除沉淀。魯哥氏液在室

溫避光條件下可保存1年。

2323

5.5市售透明油：包括顯微鏡浸沒油（nD=1.515或ne=1.518）和透明玻璃滴棒。

5.6濾膜：微孔混合纖維素酯膜（Mixtedester/cellusoseesterFilters），直徑25mm，孔徑

0.45μm～3μm。

按以下方法對每批次濾膜進(jìn)行水化測試和油透明測試，達(dá)到要求后方可使用。

（1）將一張未使用的濾膜放入盛水的燒杯中，若濾膜被水完全浸透，則濾膜可水化。

（2）另取一張未使用的濾膜，置于滴有顯微鏡浸沒油的載玻片上，若濾膜被浸沒油完全浸

潤，則濾膜可透明。

6儀器和設(shè)備

6.1正置或倒置顯微鏡：物鏡4×、10×、20×、40×；目鏡10×。

6.2真空泵：17kPa壓力以下可調(diào)。

6.3烘箱：70℃±2℃可調(diào)。

6.4微孔濾膜過濾器：包括漏斗（直徑25mm，容量200ml）、多孔聚酯濾膜支撐板、收

集瓶。

6.5蓋玻片：25mm×25mm。

6.6載玻片：25mm×76mm。

注：載玻片和蓋玻片使用前需用濃鹽酸和乙醇浸泡。若條件允許，可選擇耐潔載玻片或蓋玻片。

6.7目鏡分劃板：WHIPPLEGRID。

6.81mm鏡臺(tái)測微尺。

6.9涼片板。

6.10無齒扁咀鑷子。

6.1125號浮游生物網(wǎng)：網(wǎng)孔直徑為0.064mm，網(wǎng)呈圓錐形，網(wǎng)口套在銅環(huán)上，網(wǎng)底端有

出水開關(guān)活塞。

6.121L～2L樣品瓶、50ml樣品瓶，材質(zhì)為玻璃、聚丙烯或聚乙烯。

6.13冷藏采樣箱：2℃～8℃。

6.14一般實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備：包括去離子水設(shè)備，不同規(guī)格量筒，移液管，移液槍，燒杯，

玻璃攪拌棒等。

2

7樣品

7.1樣品的采集

浮游植物樣品采集點(diǎn)位設(shè)置參照HJ/T91等的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。若湖泊、水庫水體是圓形

或接近圓形的，應(yīng)從此岸至彼岸至少設(shè)兩個(gè)互相垂直的采樣斷面；若是狹長的區(qū)域，至少應(yīng)

設(shè)三個(gè)互相平行、間隔均勻的斷面。河流水體：在一個(gè)采樣斷面上，水面寬小于50米時(shí)，

只設(shè)中泓1條垂線；水面寬50米～100米時(shí)，在左、右岸有明顯水流處設(shè)2條垂線；水面

寬大于100米時(shí)，在左、中、右設(shè)三條垂線。

浮游植物在水體中不僅水平上有差異，而且垂直分布也有不同。一般情況下，當(dāng)湖泊、

水庫水深不足1米時(shí)，可在1/2水深處采樣；當(dāng)湖泊、水庫水深不超過2m時(shí)，可在表層下

0.5m處采樣，若水體透明度很低，可在底層加采一個(gè)樣品與表層樣品合成混合樣；若水體

超過2m時(shí)、透明度較大，可按表層、透明度的0.5倍、1倍、2.5倍和3倍處各取一個(gè)樣品，

將各層樣品混合均勻，再從混合樣品中取樣作為定量樣品；也可在有光層內(nèi)按3m~6m（或

更大間距）進(jìn)行等間距采樣。分層層數(shù)與監(jiān)測目的有關(guān)，分層越密，獲取的信息越詳細(xì)。一

般情況下，河流可不分層采樣，直接在水面下0.5m處采樣，或在下層（河底上0.5m）加采

一個(gè)樣品，兩次混合即可。若需了解浮游生物垂直分布狀況，不同層次分別采樣后，不需混

合。

有些浮游植物（如藍(lán)藻）常上浮在水面或有成片、成帶分布的情況，采樣時(shí)應(yīng)加以注意。

應(yīng)盡量保持在每天的相近時(shí)間采樣，如上午8點(diǎn)～10點(diǎn)時(shí)。

7.1.1定性樣品

使用25號浮游生物網(wǎng)（6.1）采集定性樣品。關(guān)閉浮游生物網(wǎng)底端出水開關(guān)活塞，在水

面表層至0.5m水深處以20cm/s～30cm/s的速度做“∞”形往復(fù)緩慢拖動(dòng)約1~3min，也

可沿表層至0.5m水深出緩慢拖動(dòng)，濾過1.5m3～5.0m3體積的水體。將浮游生物網(wǎng)提出水

面，水體自然通過網(wǎng)孔，待底部還剩少許水體（5ml～10ml）時(shí)，將底端出口伸入采樣瓶

（6.2）中，打開底端活塞收集定性樣品。

7.1.2定量樣品

采集1L～2L水至樣品瓶（6.12）中，立刻加入10ml魯哥氏液（5.4）固定，若浮游植

物密度過低，應(yīng)酌情增加采水量。樣品瓶也可提前加好魯哥氏液（5.4）帶至現(xiàn)場。

注意：樣品采集完成后，樣品瓶中樣品液面至瓶蓋應(yīng)留有一定空間，便于樣品混勻。

7.2樣品的保存

7.2.1定性樣品

定性樣品應(yīng)避光保存在4℃～10℃環(huán)境條件下，保存時(shí)間不超過36h。高溫環(huán)境下采

集的定性樣品在保存前需逐漸降溫，避免溫度變化過快對浮游植物細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

7.2.2定量樣品

3

每1000ml定量樣品中加入15ml魯哥氏液（5.4）。室溫避光條件下可保存3周；1℃～

5℃冷藏避光條件下可保存12個(gè)月。

樣品在保存過程中，應(yīng)每周檢查魯哥氏液的氧化程度，如果樣品顏色變淺，則應(yīng)向樣品

中補(bǔ)加適量的魯哥氏液，直至樣品顏色恢復(fù)為黃褐色。

若定量或定性樣品含大量有機(jī)質(zhì)、需儲(chǔ)存12個(gè)月以上時(shí)，應(yīng)加入甲醛溶液（5.3）固定，

每100ml樣品加4ml甲醛溶液（5.3）。

8分析步驟

8.1試樣制備

8.1.1預(yù)檢

完成預(yù)檢裝片（8.1.2～8.1.5），判斷樣品浮游植物密度（8.2.2），以便于樣品的后續(xù)分析。

8.1.2樣品搖勻

樣品過濾前，將樣品瓶水平轉(zhuǎn)動(dòng)、垂直顛倒至少30s，充分混勻，混勻動(dòng)作要輕且速度

均勻。

8.1.3過濾體積

樣品浮游植物密度在108cells/L以上時(shí)，樣品過濾體積0.5ml～2ml；樣品浮游植物密

度在107cells/L數(shù)量水平時(shí)，樣品過濾體積5ml～10ml；樣品浮游植物密度在106cells/L數(shù)

量水平時(shí)，樣品過濾體積5ml～25ml；樣品浮游植物密度在105cells/L數(shù)量水平時(shí)，樣品

過濾體積10ml～50ml。當(dāng)樣品過濾體積小于5ml時(shí)，用實(shí)驗(yàn)用水將樣品再懸浮，最后在

懸浮樣品中加幾滴魯哥氏固定液（5.4）。

注1：當(dāng)樣品過濾體積大于漏斗容量時(shí)，需保證后續(xù)樣品加入不擾動(dòng)濾膜上的浮游植物。

8.1.4樣品過濾

用量筒、定量移液器或移液槍（6.14）定量量取樣品體積，將樣品加入微孔濾膜過濾器

（6.4）漏斗中，靜止2min～3min，使用真空泵（6.2）抽濾，控制真空壓力不高于17kPa

（5inHg），抽濾至漏斗中有0.5cm液層時(shí)關(guān)掉真空泵，使剩余液體完全通過漏斗。切忌抽

干濾膜，抽濾過程一次完成，不建議后續(xù)加入樣品，以免影響濾膜上浮游植物的分布。

注：當(dāng)樣品過濾體積大于漏斗容量時(shí)，需保證后續(xù)樣品加入不擾動(dòng)濾膜上的浮游植物。

8.1.5裝片制備

樣品過濾完成后，用無齒扁咀鑷子（6.10）取下濾膜，保持有藻面朝上，放在滴有2滴

顯微鏡浸沒油（5.5）的載玻片（6.6）上，再用透明玻璃滴棒（5.5）在濾膜上滴2滴顯微鏡

浸沒油（5.5），將載玻片（6.6）放入涼片板（6.9），置于烘箱（6.3）中，70℃±2℃加熱

2h。2h后取出涼片板（6.9），觀察濾膜是否透明。若已透明，再在濾膜上滴2滴顯微鏡浸

沒油（5.5），蓋上蓋玻片（6.5），裝片制備完畢。若濾膜加熱2h后未透明，可延長加熱時(shí)

4

間，建議不超過24h。加蓋蓋玻片（6.5）時(shí)，勿擾動(dòng)濾膜。

8.2顯微計(jì)數(shù)

8.2.1顯微鏡標(biāo)定

計(jì)數(shù)前標(biāo)定顯微鏡（6.1），確定計(jì)數(shù)視野面積（Whipple視野或目鏡視場視野）。顯微鏡

標(biāo)定設(shè)備包括Whipple目鏡分化板（6.7）和1mm鏡臺(tái)測微尺（6.8）。Whipple目鏡分劃板

標(biāo)定詳見資料性附錄B。

8.2.2計(jì)數(shù)

裝片（8.1.5）置于顯微鏡（6.1）載物臺(tái)上，用whipple視野法或目鏡視場視野法進(jìn)行鏡

檢計(jì)數(shù)，記錄每個(gè)視野的浮游植物種類及數(shù)量。根據(jù)藻細(xì)胞大小，選擇200x、400x放大倍

數(shù)對藻類進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

whipple視野法計(jì)數(shù)規(guī)則：視野中處于下邊界及右邊界線的藻類計(jì)入總數(shù)（Y），處于上

邊界及左邊界線的藻類不計(jì)入總數(shù)（N）；從里到外，計(jì)數(shù)每一個(gè)接觸計(jì)數(shù)邊界的藻類，忽

略每一個(gè)接觸非計(jì)數(shù)邊界的藻類，詳見圖1。若出現(xiàn)絲狀體等較大個(gè)體顯著穿過兩個(gè)或多個(gè)

格子的邊界時(shí)，需在低倍鏡下單獨(dú)計(jì)數(shù)，再計(jì)入總數(shù)。絲狀體或似球形群體細(xì)胞數(shù)估算詳見

資料性附錄C。計(jì)數(shù)時(shí)，緩慢移動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)，確保濾膜上、下、左、右和中部區(qū)域的視

野均有抽樣。顯微鏡視野在濾膜上的移動(dòng)示例詳見圖2，需避免在一個(gè)區(qū)域重復(fù)抽樣。

較低密度樣品計(jì)數(shù)時(shí)，建議選擇目鏡視場視野法。不同樣品推薦視野類別及計(jì)數(shù)視野數(shù)

詳見表1。