水質(zhì) 滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定 生物學(xué)檢測法（征求意見稿）

目次

前言..............................................................................................................................................ii

1適用范圍....................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件........................................................................................................................1

3術(shù)語和定義................................................................................................................................1

4方法原理....................................................................................................................................1

5干擾和消除................................................................................................................................2

6試劑和材料................................................................................................................................2

7儀器和設(shè)備................................................................................................................................2

8樣品............................................................................................................................................3

9分析步驟....................................................................................................................................3

10結(jié)果與報(bào)告..............................................................................................................................6

11特異性和穩(wěn)定性.......................................................................................................................6

12質(zhì)量保證和質(zhì)量控制...............................................................................................................7

13廢物處理..................................................................................................................................7

附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑.........................................................................................8

附錄B（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑使用說明.......................................................................14

i

前言

為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國水污染防治法》，保護(hù)生態(tài)

環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定方法，制

定本標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鑒定經(jīng)滅菌處置的廢水中滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的生

物學(xué)檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A和附錄B為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。

本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海市環(huán)境監(jiān)測中心。

本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心、浙江省環(huán)境監(jiān)測中心、江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中

心、上海市松江區(qū)環(huán)境監(jiān)測站、上海市長寧區(qū)環(huán)境監(jiān)測站和上海市青浦區(qū)環(huán)境監(jiān)測站。

本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部20□□年□□月□□日批準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)自20□□年□□月□□日起實(shí)施。

本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部解釋。

ii

水質(zhì)滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定

生物學(xué)檢測法

警告：操作時(shí)應(yīng)按要求佩戴防護(hù)器具，做好無菌防護(hù)；實(shí)驗(yàn)室操作需在無菌操作設(shè)備內(nèi)

進(jìn)行，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物。

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鑒定水中滅菌指示微生物的生物學(xué)檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于經(jīng)滅菌處置的廢水中指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本

標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

枯草芽孢桿菌黑色變種Bacillussubtilisvar.niger

在含酪氨酸的培養(yǎng)基上形成黑色色素的革蘭氏陽性芽孢桿菌，其營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)

或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀

粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。

4方法原理

滅菌處置后的廢水通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細(xì)菌和芽孢被截留在濾膜上，然后

將濾膜置于酪氨酸選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72h～96h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪

氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對(duì)特征菌落進(jìn)行染色鏡檢和生

化試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性芽孢桿菌，營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，單

個(gè)或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解

淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據(jù)結(jié)果報(bào)告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

1

5干擾和消除

5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）

時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液（6.13）消除干擾。

5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品

采集（8.1）時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14）消除干擾。

6試劑和材料

除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)滿足GB/T6682

中三級(jí)水的要求。

6.1酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基。

6.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

6.3淀粉培養(yǎng)基。

6.4硝酸鹽培養(yǎng)基。

6.5甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基。

6.6甘露糖生化培養(yǎng)基。

6.7甘露醇生化培養(yǎng)基。

6.8苦杏仁苷生化培養(yǎng)基。

6.9革蘭氏染色液。

6.10芽孢染色液。

注：6.1～6.10的成分及制法詳見附錄A，其中6.2～6.10也可使用市售商品化培養(yǎng)基或試劑。

6.11硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）。

6.12乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。

6.13硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml。

稱取15.7g硫代硫酸鈉（6.11），溶于適量水中，定容至100ml，臨用現(xiàn)配。

6.14乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15g/ml。

稱取15g乙二胺四乙酸二鈉（6.12），溶于適量水中，定容至100ml，此溶液保質(zhì)期為

30d。

6.15無菌濾膜：直徑50mm，孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包扎，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，

加入實(shí)驗(yàn)用水，煮沸滅菌3次，15min/次，前2次煮沸后需更換水洗滌2～3次。

6.16石蠟質(zhì)封口膜。

6.17無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

7儀器和設(shè)備

7.1采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的500ml廣口玻璃瓶。

7.2恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差36℃±1℃。

2

7.3高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。

7.4pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位，或更高精度。也可使用pH比色管或pH精密試紙。

7.5顯微鏡：物鏡10×倍、20×倍、40×倍，油鏡100×倍，目鏡10×倍或15×倍。

7.6分析天平：感量0.0001g。

7.7培養(yǎng)皿：直徑90mm。

7.8過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。

7.9接種環(huán)。

7.10鑷子。

7.11移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。也可使用計(jì)量合格的可調(diào)式移液器。

7.12量筒：100ml。

7.13三角瓶：100ml。

7.14酒精燈。

7.15無菌操作設(shè)備：無菌室或超凈工作臺(tái)、生物安全柜。

注：移液管、采樣瓶、培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃器皿試驗(yàn)前要按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器

（7.3）121℃滅菌20min，烘干，備用。

8樣品

8.1樣品采集

點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以

除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125ml容積加入0.1ml的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的

是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以

消除干擾（每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7mg硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中1.5mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實(shí)際活性

氯量調(diào)整。

8.2樣品保存

采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能

立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。

9分析步驟

9.1方法程序

樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的鑒定程序見下圖1。

3

樣品

過濾

酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)

36℃±1℃，72h～96h

有菌落生長無菌落生長

未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種

可疑菌落

革芽甘甘甘苦淀

蘭孢油露露杏粉反應(yīng)結(jié)

氏染利糖醇仁＋果與左

染色用＋－苷側(cè)不同

色＋＋－

＋

枯草芽孢桿菌黑色變種非枯草芽孢桿菌黑色變種

注：“＋”表示反應(yīng)結(jié)果陽性，“－”表示反應(yīng)結(jié)果陰性。

圖1枯草芽孢桿菌黑色變種檢測流程

9.2樣品過濾

用滅菌鑷子（7.10）以無菌操作夾取無菌濾膜（6.15）貼放在已滅菌的過濾裝置（7.8）

上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取100ml（高濃度樣品可減少過濾樣品量或?qū)悠?/p>

稀釋）抽濾，以無菌水（6.17）沖洗器壁2～3次。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開

關(guān)。

4

9.3培養(yǎng)

用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（6.1）上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜

應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后用石蠟質(zhì)封口膜（6.17）封好培養(yǎng)皿，倒

置培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱（7.2）內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)72h～96h。

培養(yǎng)96h后，如培養(yǎng)基上未有菌落生長，則試驗(yàn)終止；如培養(yǎng)基上有菌落生長，則挑

取黑色的特征菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（6.2）上，36℃±1℃培養(yǎng)24h，待鑒定。同時(shí)將已挑

菌落的酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿儲(chǔ)存于2℃～5℃，以備必要時(shí)復(fù)查。

注：菌落顏色無法判斷時(shí)，可再次劃線接種至酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（6.1）培養(yǎng)后觀察；若菌落為灰色或

灰黑色，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間后觀察，培養(yǎng)時(shí)間不超過7d。

9.4鑒定

9.4.1染色鏡檢

挑取可疑菌落（9.3），分別使用革蘭氏染色液（6.9）和芽孢染色液（6.10）染色，具

體操作及結(jié)果觀察詳見附錄B，若使用市售商品化試劑，則按說明書操作，然后鏡檢。

100×100×

左——革蘭氏染色；右——芽孢染色。

圖2枯草芽孢桿菌黑色變種染色鏡檢圖

9.4.2生化試驗(yàn)

挑取特征菌落（9.3），分別接種到淀粉培養(yǎng)基（6.3）、硝酸鹽培養(yǎng)基（6.4）、甘油復(fù)

紅肉湯培養(yǎng)基（6.5）、甘露糖生化培養(yǎng)基（6.6）、甘露醇生化培養(yǎng)基（6.7）和苦杏仁苷生

化培養(yǎng)基（6.8）上，具體操作及結(jié)果觀察詳見附錄B，若使用市售商品化培養(yǎng)基，則按說

明書操作。

9.5對(duì)照試驗(yàn)

9.5.1空白對(duì)照

每次試驗(yàn)都要用無菌水（6.17）按照步驟9.2和9.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測定。

培養(yǎng)后平皿應(yīng)無菌生長，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。

5

9.5.2陰性及陽性對(duì)照

將陽性菌株和陰性菌株制成濃度為40～600CFU/L的菌懸液，分別按照9.2～9.4步驟操

作，陰性、陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)的生化反應(yīng)結(jié)果應(yīng)與表1給出的結(jié)果一致，否則，該次樣品鑒

定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新鑒定。

表1陰性、陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)的生化反應(yīng)結(jié)果

陽性菌株陰性菌株

特征指標(biāo)

枯草芽孢桿菌黑色變種地衣芽孢桿菌

酪氨酸培養(yǎng)基灰色、灰黑色或黑色菌落乳白色菌落

革蘭氏染色＋＋

芽孢染色＋＋

淀粉水解＋＋

硝酸鹽還原＋＋

甘油利用＋＋

甘露糖利用＋＋

甘露醇利用－＋

苦杏仁苷利用－＋

注：“＋”表示陽性，“－”表示陰性。

10結(jié)果與報(bào)告

結(jié)果判定：符合9.4、9.5，可鑒定為枯草芽孢桿菌黑色變種。

結(jié)果報(bào)告：樣品中檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

11穩(wěn)定性和特異性

11.1穩(wěn)定性

6家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液（按芽孢計(jì)）高濃度（106個(gè)/100ml）、

中濃度（104個(gè)/100ml）、低濃度（102個(gè)/100ml）進(jìn)行檢測，檢出率均為100%，方法穩(wěn)定

性高。

11.2特異性

6家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)枯草芽孢桿菌黑色變種和地衣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行方法特異性檢

6

測，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌黑色變種的檢出率為100%，方法特異性強(qiáng)。

12質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

12.1按照對(duì)照試驗(yàn)（9.5），每批樣品均應(yīng)進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)，定期進(jìn)行陰性及陽性對(duì)照

試驗(yàn)定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陰性、陽性對(duì)照試驗(yàn)。

12.2每20個(gè)樣品或每批次樣品（≤20個(gè)/批）測定一個(gè)平行雙樣。

12.3對(duì)每批次培養(yǎng)基須使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)量檢驗(yàn)。

12.4定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。

13廢物處理

實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢物經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后，作為一般廢物處理。

7

附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑

A.1酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基

A.1.1成分

A.1.1.1組分A

L-天冬酰胺0.5g

L-酪氨酸0.5g

A.1.1.2組分B

氯化鈉0.5g

胰蛋白胨0.5g

干酪素0.5g

葡萄糖0.5g

磷酸氫二鉀0.5g

七水硫酸鎂0.5g

微量鹽溶液1ml

瓊脂20g

蒸餾水1000ml

其中微量鹽溶液配方：

七水合硫酸亞鐵1.360g

二水合氯化銅0.027g

六水合氯化鈷0.040g

二水合鉬酸鈉0.025g

氯化鋅0.020g

硼酸2.850g

四水合二氯化錳1.800g

酒石酸鈉1.770g

蒸餾水1000ml

A.1.2制法

加熱溶解組分B后，再加入組分A，攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0左右。121℃滅菌

15min。滅菌后的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，每皿25～30ml，待用。

8

A.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

A.2.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0g～20.0g

蒸餾水1000ml

A.2.2制法

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，

使瓊脂溶化，121℃高壓滅菌15min。

A.3淀粉培養(yǎng)基

A.3.1成分

蛋白胨5.0g～10.0g

酵母浸膏1.0g

牛肉膏3.0g

淀粉2.0g

瓊脂15.0g～20.0g

蒸餾水1000ml

A.3.2制法

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，

使瓊脂溶化，121℃高壓滅菌20min。倒平板備用。

A.3.3試劑-碘液

A.3.3.1成分

碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水300ml

A.3.3.2制法

將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至

300ml。

9

A.4硝酸鹽還原培養(yǎng)基

A.4.1硝酸鹽培養(yǎng)基

A.4.1.1成分

肉汁胨培養(yǎng)基1000ml

KNO31.0g

A.4.1.2制法

將KNO3溶于肉汁胨培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.6，分裝于試管，每管分裝4ml～5ml，

121℃蒸汽滅菌15min～20min。

A.4.2試劑-格里斯氏（Griess）試劑

A.4.2.1成分

A液：

對(duì)氨基苯磺酸0.5g

稀醋酸（10%左右）150ml

B液：

α-萘胺0.1g

蒸餾水20ml

稀醋酸（10%左右）150ml

A.4.2.2制法

將對(duì)氨基苯磺酸溶于稀醋酸中，制成A液；將α-萘胺溶于稀醋酸中，用蒸餾水稀釋，

制成B液。

A.4.3試劑-二苯胺試劑

A.4.3.1成分

二苯胺0.5g

濃硫酸（98.3%）100ml

蒸餾水20ml

A.4.3.2制法

將二苯胺溶于濃硫酸中，用20ml蒸餾水稀釋。

10

A.5甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基

A.5.1成分

蛋白胨20g

甘油10ml

無水氯化鎂1.4g

無水硫酸鉀10g

堿性品紅1.0g

蒸餾水1000ml

A.5.2制法

取蛋白胨、無水氯化鎂和無水硫酸鉀加入水中，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，加入

甘油，加熱溶化，混勻，分裝于試管，121℃高壓滅菌20min。

A.6甘露糖培養(yǎng)基/甘露醇培養(yǎng)基

A.6.1成分

(NH4)2HPO41.0g

KCl0.2g

MgSO40.2g

酵母膏0.2g

瓊脂5g～6.0g

甘露糖/甘露醇10.0g

蒸餾水1000ml

溴甲酚紫(0.04%)15ml

A.6.2制法

將以上成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4cm～5cm，

112℃蒸汽滅菌30min。

A.7苦杏仁苷培養(yǎng)基

A.7.1成分

蛋白胨5g

溴甲酚紫（1.6%）0.625ml

牛肉膏5g

D-葡萄糖0.5g

瓊脂3g～6g

11

苦杏仁苷5mg

蒸餾水1000ml

A.7.2制法

將以上成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0～6.3，分裝小試管，每管3ml～4ml，121℃滅菌

10min。

A.8革蘭氏染色液

A.8.1結(jié)晶紫染色液

A.8.1.1成分

結(jié)晶紫1.0g

95％乙醇20ml

1％草酸銨水溶液80ml

A.8.1.2制法

將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.8.2革蘭氏碘液

A.8.2.1成分

碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水300ml

A.8.2.2制法

將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至

300ml。

A.8.3沙黃復(fù)染液

A.8.3.1成分

沙黃0.25g

95％乙醇10ml

蒸餾水90ml

A.8.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

12

A.9芽孢染色液

A.9.1飽和孔雀綠水溶液

A.9.1.1成分

孔雀綠7.6g

蒸餾水100ml

A.9.1.2制法

將孔雀綠加入蒸餾水充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水定容至100ml。

A.9.20.5%番紅溶液

A.9.2.1成分

番紅0.5g

蒸餾水100ml

A.9.1.2制法

將番紅加入蒸餾水充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水定容至100ml。

13

附錄B

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑使用說明及結(jié)果觀察

B.1淀粉培養(yǎng)基

B.1.1操作

將待檢菌株接種于淀粉培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時(shí)間，形成明顯菌落后，在平板

上滴加碘液。

B.1.2結(jié)果觀察

平板呈藍(lán)黑色，菌落周圍如有不變色透明圈，為淀粉水解陽性；仍是藍(lán)黑色為陰性。

B.2硝酸鹽培養(yǎng)基

B.2.1操作

將測定菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置于適溫培養(yǎng)1d～5d。每株菌作2個(gè)重復(fù)，另

留兩管不接種作為對(duì)照。取兩支干凈的空試管或在比色瓷盤小窩中倒入少許培養(yǎng)1d～5d

的培養(yǎng)液，再各滴加一滴A液及B液。

B.2.2結(jié)果觀察

當(dāng)培養(yǎng)液中滴加A液、B液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表示亞

硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。如無紅色出現(xiàn)，可滴加一、二滴二苯胺試劑，此時(shí)如呈

藍(lán)色反應(yīng)，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，又無亞硝酸鹽反應(yīng)，表示無硝酸鹽還原作用，為硝

酸鹽還原陰性；如不呈藍(lán)色反應(yīng)，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)，故

仍按硝酸鹽還原陽性處理。

B.3甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基

B.3.1操作

取被檢菌接種于甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)，觀察2d～8d。

B.3.2結(jié)果觀察

培養(yǎng)液顏色變?yōu)樽霞t色，表示甘油被細(xì)菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，

乙醛與無色的復(fù)紅生成深紫紅色的醌式化合物，為陽性；否則為陰性。

14

B.4甘露糖培養(yǎng)基/甘露醇培養(yǎng)基

B.4.1操作

用菌株穿刺接種于上述培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)1d～5d后觀察。

B.4.2結(jié)果觀察

若培養(yǎng)后培養(yǎng)物變黃，表示產(chǎn)酸，為陽性；不變色或變藍(lán)（紫）為陰性。

B.5苦杏仁苷培養(yǎng)基

B.5.1操作

用菌株穿刺接種于苦心仁苷培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)，接種后封油。

B.5.2結(jié)果觀察

指示劑呈黃色者為陽性，呈紫色為陰性。

B.6革蘭氏染色液

B.6.1操作

a）涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗。

b）滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。

c）滴加95％乙醇脫色約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。

d）滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。

B.6.2結(jié)果觀察

呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽性菌，呈紅色為革蘭氏陰性菌。

B.7芽孢染色液

B.7.1操作

a）將生有芽孢的菌涂片，火焰上固定，用飽和孔雀綠水溶液染色10min，水洗。

b）滴加0.5%番紅溶液復(fù)染30s，水洗，吸干。

c）鏡檢。

B.7.2結(jié)果觀察

菌體呈紅色，芽孢呈綠色。

15

中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)

HJ□□□-20□□

水質(zhì)滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌

黑色變種）的鑒定生物學(xué)檢測法

Waterquality—Certificationofsterilizingindicatormicroorganism(B.

subtilisvar.niger)—Biologicaldetectionmethod

（征求意見稿）

水質(zhì)滅菌指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定

生物學(xué)檢測法

警告：操作時(shí)應(yīng)按要求佩戴防護(hù)器具，做好無菌防護(hù)；實(shí)驗(yàn)室操作需在無菌操作設(shè)備內(nèi)

進(jìn)行，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物。

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鑒定水中滅菌指示微生物的生物學(xué)檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于經(jīng)滅菌處置的廢水中指示微生物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本

標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

枯草芽孢桿菌黑色變種Bacillussubtilisvar.niger

在含酪氨酸的培養(yǎng)基上形成黑色色素的革蘭氏陽性芽孢桿菌，其營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)

或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀

粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。

4方法原理

滅菌處置后的廢水通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細(xì)菌和芽孢被截留在濾膜上，然后

將濾膜置于酪氨酸選擇性培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72h～96h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪

氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對(duì)特征菌落進(jìn)行染色鏡檢和生

化試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性芽孢桿菌，營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，單

個(gè)或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解

淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據(jù)結(jié)果報(bào)告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

1

5干擾和消除

5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集（8.1）

時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液（6.13）消除干擾。

5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品

采集（8.1）時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14）消除干擾。

6試劑和材料

除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)滿足GB/T6682

中三級(jí)水的要求。

6.1酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基。

6.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

6.3淀粉培養(yǎng)基。

6.4硝酸鹽培養(yǎng)基。

6.5甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基。

6.6甘露糖生化培養(yǎng)基。

6.7甘露醇生化培養(yǎng)基。

6.8苦杏仁苷生化培養(yǎng)基。

6.9革蘭氏染色液。

6.10芽孢染色液。

注：6.1～6.10的成分及制法詳見附錄A，其中6.2～6.10也可使用市售商品化培養(yǎng)基或試劑。

6.11硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）。

6.12乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。

6.13硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml。

稱取15.7g硫代硫酸鈉（6.11），溶于適量水中，定容至100ml，臨用現(xiàn)配。

6.14乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15g/ml。

稱取15g乙二胺四乙酸二鈉（6.12），溶于適量水中，定容至100ml，此溶液保質(zhì)期為

30d。

6.15無菌濾膜：直徑50mm，孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包扎，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，

加入實(shí)驗(yàn)用水，煮沸滅菌3次，15min/次，前2次煮沸后需更換水洗滌2～3次。

6.16石蠟質(zhì)封口膜。

6.17無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

7儀器和設(shè)備

7.1采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的500ml廣口玻璃瓶。

7.2恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差36℃±1℃。

2

7.3高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。

7.4pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位，或更高精度。也可使用pH比色管或pH精密試紙。

7.5顯微鏡：物鏡10×倍、20×倍、40×倍，油鏡100×倍，目鏡10×倍或15×倍。

7.6分析天平：感量0.0001g。

7.7培養(yǎng)皿：直徑90mm。

7.8過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。

7.9接種環(huán)。

7.10鑷子。

7.11移液管：1ml±0.01ml、10ml±0.1ml。也可使用計(jì)量合格的可調(diào)式移液器。

7.12量筒：100ml。

7.13三角瓶：100ml。

7.14酒精燈。

7.15無菌操作設(shè)備：無菌室或超凈工作臺(tái)、生物安全柜。

注：移液管、采樣瓶、培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃器皿試驗(yàn)前要按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器

（7.3）121℃滅菌20min，烘干，備用。

8樣品

8.1樣品采集

點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以

除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125ml容積加入0.1ml的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的

是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以

消除干擾（每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7mg硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中1.5mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實(shí)際活性

氯量調(diào)整。

8.2樣品保存

采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能

立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。

9分析步驟

9.1方法程序

樣品中枯草芽孢桿菌黑色變種的鑒定程序見下圖1。

3

樣品

過濾

酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)

36℃±1℃，72h～96h

有菌落生長無菌落生長

未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種

可疑菌落

革芽甘甘甘苦淀

蘭孢油露露杏粉反應(yīng)結(jié)

氏染利糖醇仁＋果與左

染色用＋－苷側(cè)不同

色＋＋－

＋

枯草芽孢桿菌黑色變種非枯草芽孢桿菌黑色變種

注：“＋”表示反應(yīng)結(jié)果陽性，“－”表示反應(yīng)結(jié)果陰性。

圖1枯草芽孢桿菌黑色變種檢測流程

9.2樣品過濾

用滅菌鑷子（7.10）以無菌操作夾取無菌濾膜（6.15）貼放在已滅菌的過濾裝置（7.8）

上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取100ml（高濃度樣品可減少過濾樣品量或?qū)悠?/p>

稀釋）抽濾，以無菌水（6.17）沖洗器壁2～3次。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開

關(guān)。

4

9.3培養(yǎng)

用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（6.1）上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜

應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后用石蠟質(zhì)封口膜（6.17）封好培養(yǎng)皿，倒

置培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱（7.2）內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)72h～96h。

培養(yǎng)96h后，如培養(yǎng)基上未有菌落生長，則試驗(yàn)終止；如培養(yǎng)基上有菌落生長，則挑

取黑色的特征菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基