GB∕T 43163-2023 苜蓿黃萎病菌溯源檢測(cè)方法（正式版）

苜蓿黃萎病菌溯源檢測(cè)方法2023-09-07發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國(guó)深圳海關(guān)、深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。1苜蓿黃萎病菌溯源檢測(cè)方法1范圍本文件描述了應(yīng)用基因片段和生物信息學(xué)分析方法對(duì)苜蓿黃萎病菌進(jìn)行溯源檢測(cè)的方法。本文件適用于苜蓿黃萎病菌相關(guān)寄主植物材料中攜帶的苜蓿黃萎病菌的溯源檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。鄰接法neighbor-joining基于最小演化準(zhǔn)則的迭代聚類方法。4方法原理苜蓿黃萎病菌，拉丁名Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold,基本信息見(jiàn)附錄A。溯源是利用對(duì)物種有進(jìn)化和溯源價(jià)值的基因片段將核酸序列信息與來(lái)源地、寄主等來(lái)源信息進(jìn)行相關(guān)性歸類。檢測(cè)過(guò)程是應(yīng)用生物信息學(xué)的分析手段篩選有效區(qū)分種內(nèi)差異并且有效歸類的基因片段或分子標(biāo)記，獲得這些基因片段或分子標(biāo)記的核酸序列，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段完成核酸序列與來(lái)源地、寄主信息的主成分分析，完成不同來(lái)源地、寄主個(gè)體的群體分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)分析，基于基因序列的相似度和重復(fù)率等，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖。5儀器和試劑5.1儀器與試驗(yàn)用具5.2試劑試劑：70%酒精、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、PCRTaq酶、PCRTaq緩沖液、dNTP、DNA標(biāo)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):200g去皮土豆切成小方塊，加入1000mL無(wú)菌水，煮沸15min,四層紗布過(guò)濾得到濾液，濾液中加入18g葡萄糖、18g瓊脂粉，加熱溶解后將溶液定容至1000mL,分裝至三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20min。26溯源檢測(cè)方法6.1DNA提取與純化對(duì)真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)或平板培養(yǎng)，按附錄B中CTAB法對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，溶解于無(wú)菌超純水中，測(cè)定DNA濃度及純度后，保存于一20℃冰箱備用。6.2基因片段或分子標(biāo)記的擴(kuò)增與測(cè)序內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS片段)作為溯源分析的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(具體步驟見(jiàn)附錄C),測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用通用序列編輯軟件進(jìn)行剪接編輯，比對(duì)峰圖和正反向測(cè)序結(jié)果是否有誤，去掉兩端引物部分序列。6.3分子系統(tǒng)進(jìn)化分析將拼接的序列導(dǎo)入通用分子系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件，同時(shí)導(dǎo)入苜蓿黃萎病菌溯源序列排列文件mas格式或meg格式，對(duì)全部序列進(jìn)行排列，排列結(jié)果見(jiàn)附錄D。對(duì)排列后的mas格式文件，基于鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)附錄E)。選擇Bootstrap檢驗(yàn)1000次重復(fù)，其他參數(shù)選擇默認(rèn)參數(shù)。7結(jié)果判定根據(jù)待分析序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與已溯源苜蓿黃萎病菌的分支聚集結(jié)果進(jìn)行判定?！绻蛄信c已溯源菌株序列聚為一支，且自展值為100%,即可判定該物種序列與已知溯源信息序列具有相同的來(lái)源地、寄主信息?！绻蛄信c已溯源菌株序列未與任一物種序列聚為一支，需結(jié)合網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖做出判定。在構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖中尋找待分析序列的進(jìn)化分支起源點(diǎn)和方向，確認(rèn)突變衍化歷史?！缤环种鹪袋c(diǎn)的其他方向分支信息具有相關(guān)性，則可判定待分析個(gè)體與同一起源點(diǎn)不同個(gè)體的來(lái)源地和寄主信息具有相關(guān)性?！绻环种鹪袋c(diǎn)無(wú)其他方向分支，則無(wú)法判定待分析個(gè)體的來(lái)源地和寄主信息。8樣品與原始數(shù)據(jù)集保存8.1樣品保存分離得到的菌種轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基，置于4℃黑暗條件下保存至少6個(gè)月，以備復(fù)8.2結(jié)果記錄與資料保存和審核人員簽字。PCR凝膠電泳檢測(cè)需有電泳結(jié)果照片，序列需要保存電子文件。3(資料性)苜蓿黃萎病菌相關(guān)信息A.1基本信息分類地位：Fungi,Plectosphaerellaceae,Glomerellales,Hypocreomycetidae,Sordariomycetes,As-comycota。A.2寄主范圍exserta、草莓Fragariaananassa、大豆屬Glycine、大豆Glycinemax、地中海巖黃芪Hedysarumcoro-narium、栽培向日葵Helianthusannuusvar.marcocarpus、律草屬Humulus、啤酒花HumulusMedicago、紫苜蓿Medicagosativa、草木犀屬M(fèi)elilotus、草木犀Melilotussuaveolens、驢喜豆Onobry-pratense、白車軸草Trifoliumrepens、蠶豆Viciafaba。A.3地理分布A.4癥狀病株初期上部葉片在溫度較高時(shí)表現(xiàn)暫時(shí)性萎蔫，繼而中下部葉片失綠變黃，嚴(yán)重時(shí)變枯白色，表現(xiàn)整株萎蔫癥狀，橫切病株莖部，可見(jiàn)維管束變褐。發(fā)病后期，植株因生育停滯而嚴(yán)重矮化。小葉頂端出現(xiàn)V形黃變壞死斑塊，嚴(yán)重時(shí)病葉卷縮扭曲；病株葉片枯萎，但莖部在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍保持綠色；在潮濕條件下，枯死莖表現(xiàn)為病原菌輪枝狀分生孢子梗覆蓋，呈灰色。4GB/T43163—2023(規(guī)范性)基因組DNA制備B.1.1試驗(yàn)器皿于121℃、30min濕熱滅菌或180℃干熱滅菌1h。B.1.2從培養(yǎng)基上刮取100mg左右的菌絲體至研缽內(nèi)，加入液氮充分研磨，加入4mL預(yù)熱的CTAB抽提液。B.1.3將離心管放入水浴鍋前先振蕩1min,然后放入65℃水浴鍋水浴15min,每隔3min～5min振B.1.4加入等體積三氯甲烷，用移液器混勻1min,水浴10min;4℃,12000g離心15min,取上清液加等體積異丙醇，輕輕搖勻，然后一20℃靜置15min。B.1.54℃,12000g離心15min,小心去除上清液，留沉淀；加70%預(yù)冷酒精，洗滌3次，放于通風(fēng)處干燥；加入50μL～100μL滅菌的去離子水溶B.2DNA濃度及純度測(cè)定用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA的純度與濃度，分別取得260nm和280nm處的吸收值，計(jì)算核酸的純度和濃度，按照公式(B.1)計(jì)算DNA純度，按照公式(B.2)計(jì)算DNA濃度：p=50×OD?…………(B.2)式中：conc.——DNA純度；p——DNA質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);OD?s?——260nm處吸光光度值，核酸的吸光度；OD?so——280nm處吸光光度值，蛋白質(zhì)的吸光度。計(jì)算結(jié)果保留一位小數(shù)。PCR級(jí)DNA溶液的OD?so/OD?s比值為1.7～1.9。5(資料性)溯源基因片段擴(kuò)增流程C.1.1反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,56℃復(fù)性20s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。C.1.2引物序列前向引物：ITS1:5'-TCCGTAGGTC.1.3擴(kuò)增體系及條件擴(kuò)增反應(yīng)的組成成分見(jiàn)表C.1。表C.1PCR擴(kuò)增體系組分組分加樣量10×PCR緩沖液后向引物(10μmol/L)5U/μLTaq酶補(bǔ)無(wú)菌水至反應(yīng)用雙蒸水作空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照采用含有苜蓿黃萎病菌的DNA作為模板，每個(gè)樣品重復(fù)2次。C.2測(cè)序與序列處理擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA標(biāo)記參照，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，采用核酸蛋白分析儀對(duì)DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同，進(jìn)行測(cè)序。6(資料性)已鑒定苜蓿黃萎病菌溯源序列排列結(jié)果>AB353342.1Japan-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>DQ266223.1England-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>GQ495790.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC>AF108476.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCC>★AB458830.1Xinjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATT7CATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCT>JQ629956.1Slovenia-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>DQ825977.1USA-ApiumgraveolensCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC>AF364015.1Belgium-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC>AY555954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC8>AF364014.1Netherlands-Tomato/LycopersiconesculentumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC>AY555953.1UK-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★FJ900212.1USA-Alfalfa/MedicaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★GQ336791.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★GQ336790.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC9>★GU291258.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★AF364013.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>AF364011.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★AY555955.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>KC592083.1Australia-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCT>DQ825978.1Netherlands-butterbur/PetasiteshybridusCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCT>JQ629954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★JN187990.1USA-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCGGTGTTAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCT>HE972035.1Netherlands-Tomato/LycCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>JN187994.1UK-Potato/SolanumGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCACTTTGTGAACCAAATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTCCATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAAATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCCGGTGCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGG>JQ629955.1Netherlands-TomatoTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAATCTAGCACCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>HE972033.1UK-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>HE972032.1USA-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTA>JQ629952.1UK-PotatoTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTA>AY536044.1Iran-ACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>JQ629950.1Xingjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>DQ825979.1UK-UrtCCCTTTGTGAACCAAATTGTTTGCTTCGGCGGCTCGCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGGCACCAGCCTC>AF364016.1Netherlands-S.tubeCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>JN188015.1UK-PotatoCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>JN188016.1UK-PotatoCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>JN188017.1UK-PotatoCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>KC592084.1Australia-PotCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGA