基因治療載體的研究現(xiàn)狀(一)

基因治療載體的研究現(xiàn)狀(一)【關(guān)鍵詞】基因；治療;載體

基因治療是一種新的治療手段，可用于多種疾病的治療，包括癌癥、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等.基因治療通常是指將遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）引入到患者的細(xì)胞中，以達(dá)到治療疾病的目的的方法〔1～3〕.它是伴隨著DNA重組技術(shù)的成熟而發(fā)展起來的新型的分子學(xué)治療手段，是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)發(fā)展中的重大突破.1968年，美國科學(xué)家邁克爾·布萊澤首次在醫(yī)學(xué)界提出了基因治療的概念.1990年，美國科學(xué)家Anderson等進(jìn)行了首例真正意義上的基因治療臨床試驗(yàn)，獲得了初步成功〔4〕.在基因治療過程中，基因?qū)胂到y(tǒng)是最關(guān)鍵的技術(shù).目前，在基因?qū)胼d體方面出現(xiàn)了兩大主流，即病毒載體系統(tǒng)及非病毒載體系統(tǒng).本文對(duì)基因治療載體應(yīng)用的原理、種類和研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述.

1病毒載體

外源基因進(jìn)入細(xì)胞中通常需要運(yùn)輸工具，而病毒是在漫長的自然進(jìn)化過程中存活下來的無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的最小、最簡單的生命寄生形式.病毒通?？梢愿咝实剡M(jìn)入特定的細(xì)胞，表達(dá)自身蛋白，產(chǎn)生新的病毒粒子，因此被改造的病毒首先成為了基因治療的載體.病毒載體在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，約70%的治療方案采用病毒載體〔5，6〕.病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體及單純皰疹病毒載體等.

1.1反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒屬于正鏈RNA病毒，可高效地感染許多類型的宿主細(xì)胞，并可穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因組中，是最先被改造且應(yīng)用最廣泛的基因治療載體.反轉(zhuǎn)錄病毒基因組長度約為10kb，含有3個(gè)最重要的基因，即gag（編碼核心蛋白），pol（編碼反轉(zhuǎn)錄酶），env（編碼病毒外膜蛋白）.基因排列順序是5＇gagpolenv3＇，兩端存在長末端重復(fù)區(qū)（LTRS），用于介導(dǎo)病毒的整合，env基因中含有病毒包裝所必需的序列.另外，一些反轉(zhuǎn)錄病毒中存在原癌基因，其突變會(huì)引發(fā)癌變，當(dāng)被整合到宿主細(xì)胞的原癌基因附近或插入到宿主細(xì)胞的抑癌基因中時(shí)也可引發(fā)癌變.構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體多采用鼠白血病病毒（MoMLV），其為嗜雙性病毒，既可感染鼠細(xì)胞，亦可感染人細(xì)胞.反轉(zhuǎn)錄病毒載體的基本成分包括：1）必需的病毒基因組分，如LTRS、病毒的包裝識(shí)別信號(hào)、翻譯所需的剪接識(shí)別位點(diǎn)及poly（A）尾等;2）高效的治療基因，如抑癌基因及自殺基因等;3）標(biāo)記基因，用于篩選;4）其他質(zhì)粒必要成分.在應(yīng)用上，攜帶外源目的基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體需要包裝細(xì)胞（如ProPak及PA317細(xì)胞系）才能成為成熟的重組假病毒粒子，其原因?yàn)樵跇?gòu)建的復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，外源目的基因取代了病毒的必需基因，此時(shí)病毒只有借助包裝細(xì)胞提供的反式作用蛋白，才能包裝產(chǎn)生子代重組病毒.這種子代重組病毒僅具備一次感染性，避免了在人體細(xì)胞間擴(kuò)散感染，亦降低了病毒本身的致癌性及致病性.作為基因治療載體，反轉(zhuǎn)錄病毒載體具有感染率高，可穩(wěn)定整合表達(dá)，宿主范圍廣泛及對(duì)宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在僅感染正在分裂的細(xì)胞，可能致癌及包裝外源DNA?。ǎ?kb）等缺陷.目前，在基礎(chǔ)與臨床研究中此類病毒載體多適用于間接體內(nèi)基因治療，特別是腫瘤的基因治療.但重組反轉(zhuǎn)錄病毒的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，外源基因隨機(jī)插入，可能導(dǎo)致突變.慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,區(qū)別于一般的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，轉(zhuǎn)移基因片段容量較大，轉(zhuǎn)染所需的病毒滴度可達(dá)（1～10）7×MU/L，目的基因表達(dá)時(shí)間長，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，對(duì)淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率〔7～10〕.

1.2腺病毒載體腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少存在100種以上的血清型.腺病毒基因組長度約為36kb，兩端各有1個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)，其內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào).腺病毒基因組上分布著4個(gè)早期轉(zhuǎn)錄元（E1,E2,E3,E4）承擔(dān)調(diào)節(jié)功能，和1個(gè)晚期轉(zhuǎn)錄元負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)蛋白編碼.作為基因治療的載體，腺病毒載體具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）基因包裝容量較大，因而可插入大片段外源基因，最多可達(dá)35kb；2）感染效率高，可高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組織細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率接近100%轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；3)可轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞；4)在細(xì)胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產(chǎn)量；5）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬間表達(dá)，因而安全性較高.第一代腺病毒載體為E1或E3基因缺失，缺失區(qū)插入外源治療基因，但此型載體可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)，且表達(dá)外源基因的時(shí)間較短.第二代腺病毒載體則另外讓E2a或E4基因缺失，產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)，在載體容量和安全性方面亦有較大改進(jìn).第三代腺病毒載體缺失了全部的（無病毒載體）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒載體），僅保留反向末端重復(fù)區(qū)和包裝信號(hào)序列，最多可插入35kb的基因，且所引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)更弱，在它的載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因可使外源基因保持長期表達(dá)，并可增加穩(wěn)定性.

1.3腺相關(guān)病毒載體腺相關(guān)病毒屬于非致病性的微小病毒科家族成員，只有依賴于輔助病毒才可能增殖.腺相關(guān)病毒基因組很小，如2型腺相關(guān)病毒是由4681個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA，包含2個(gè)基因，即rep基因（編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、結(jié)構(gòu)基因表達(dá)和整合到宿主基因組中的蛋白）及cap基因（編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白），基因組的1個(gè)末端存在1個(gè)145bp的末端重復(fù)區(qū).腺相關(guān)病毒可感染分裂期及靜止期細(xì)胞,能插入到宿主細(xì)胞染色體內(nèi),或以染色體外串聯(lián)體DNA的形式長期穩(wěn)定表達(dá)，可有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)腦、骨骼肌及肝臟等類型的細(xì)胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特點(diǎn)，被認(rèn)為是目前最好