(高清版)GBT 18638-2021 流行性乙型腦炎診斷技術(shù)

代替GB/T18638—2002流行性乙型腦炎診斷技術(shù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) I Ⅱ 4臨床診斷 2 37病毒RT-PCR檢測(cè)方法 5 79血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法 9 12病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)方法 附錄A(規(guī)范性附錄)病毒RT-PCR檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制 附錄B(規(guī)范性附錄)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法用試劑配制 附錄C(規(guī)范性附錄)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法的預(yù)備試驗(yàn) 附錄D(資料性附錄)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法及血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法結(jié)果判定示意圖 附錄E(規(guī)范性附錄)間接ELISA抗體檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制 附錄F(規(guī)范性附錄)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制 IGB/T18638—2021本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18638—2002《流行性乙型腦炎診斷技術(shù)》,與GB/T18638—2002相比，除編輯——增加了“規(guī)范性引用文件”(見(jiàn)第2章);——增加了“病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)方法”(見(jiàn)第12章);——增加了病毒RT-PCR檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制(見(jiàn)附錄A);——增加了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法及血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法結(jié)果判定示意圖(見(jiàn)附錄D);抗體檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制(見(jiàn)附錄E);—-—增加了間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制(見(jiàn)附錄F)。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所、溫州大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：ⅡGB/T18638—2021流行性乙型腦炎(Japaneseencephalitis)又稱日本乙型腦炎，是由流行性乙型腦炎病毒引起的一種蚊媒性人獸共患傳染病。馬呈現(xiàn)腦炎癥狀，豬表現(xiàn)流產(chǎn)、死胎和睪丸炎，其他家畜和家禽大多呈隱性感很大的危害和損失。引起本病的病原體為流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus),該病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),是一種單股RNA病毒，病毒粒子呈球形，有脂蛋白的囊膜，具清中和試驗(yàn)等方法進(jìn)行診斷。我國(guó)對(duì)該病的研究報(bào)道較多，目前比較常用的診斷方法仍是本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定熒光試驗(yàn)和病毒中和試驗(yàn)。進(jìn)行病毒分離鑒定時(shí)，要求所有樣品處理應(yīng)在可保證生物安全的相應(yīng)級(jí)別實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行操作；處理樣品使用過(guò)的容器、物品、實(shí)驗(yàn)材料均應(yīng)經(jīng)有效消毒處理后方可運(yùn)離實(shí)驗(yàn)室。本標(biāo)準(zhǔn)的修訂參考了OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》2018版(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,2018),并結(jié)合了我國(guó)相關(guān)技術(shù)研究新成果。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，GB/T18638—2021流行性乙型腦炎診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流行性乙型腦炎(Japaneseencephalitis,JE)的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷的技術(shù)要求。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BBS硼酸鹽緩沖液(boratebufferedsaline)CFT補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complementfixationtest)CPE細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect)DEPC焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)DNA脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTP脫氧核糖三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay)FITC異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate)HRP辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase)JEV流行性乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)PBS磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline)RNA核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction)TCID50半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(mediantissuecultureinfectivedose)4臨床診斷4.2.2馬感染后體溫升高(39℃~41℃),出現(xiàn)神經(jīng)癥狀(沉郁或狂躁不安),姿勢(shì)異常，走路搖晃或轉(zhuǎn)—2GB/T18638—20214.3.2.3呈小膠質(zhì)細(xì)胞增生反應(yīng)，并呈衛(wèi)星現(xiàn)象——假嗜神經(jīng)或嗜神經(jīng)。4.4.1易感動(dòng)物出現(xiàn)上述臨床癥狀和病理變化，可判定為疑似JEV感染。4.4.2確診應(yīng)采集樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。5實(shí)驗(yàn)室診斷樣品采集及處理5.1.2G5級(jí)玻璃濾器。5.1.6醫(yī)用防護(hù)服。5.2試劑5.2.1漢克氏(Hank's)液。5.2.20.5%水解乳蛋白Hank's液。5.2.320000IU/mL青霉素液。5.2.420000μg/mL鏈霉素液。樣品采集的生物安全措施符合GB/T18088的規(guī)定。在流行性乙型腦炎流行早期和發(fā)病早期(即病毒血癥階段),無(wú)菌采集動(dòng)物的腦脊髓液，每頭應(yīng)不少3GB/T18638—2021于1mL,穿刺部位在兩髂連線中點(diǎn)稍下方第七腰椎間隙。無(wú)菌采集病畜血液，每頭應(yīng)不少于5mL,無(wú)菌分離血清，裝入離心管中，加蓋密封后冷藏或冷凍保存。樣品處理的生物安全措施符合GB19489的規(guī)定。將采集的動(dòng)物腦組織或睪丸組織在組織研磨器中充分研磨，加入青霉素500IU/mL和鏈霉素500μg/mL,加入0.5%水解乳蛋白Hank's液，制成10%懸液，4℃浸泡3h～4h,3000r/min離心6病毒分離鑒定6.1.125cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。6.2.17%碳酸氫鈉液。6.2.21%胰蛋白酶液。6.2.31%酚紅(中性)液。6.2.4最低必要成分培養(yǎng)液(MEM)。6.3.1清潔級(jí)BALB/c小鼠(6g～8g)。4GB/T18638—20216.3.4非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)。小鼠10只(或3日齡乳鼠1窩),用左手固定，在耳與眼之間用碘酒消毒，右手持吸取接種樣品的0.5mL注射器在消毒部位刺入6.4.1.3盲傳：若接種小鼠(或乳鼠)第一代96h后未見(jiàn)發(fā)病癥法將小鼠(或乳鼠)腦組織制成1:5組織懸液，按6.4.1.1所述方法再次接種小鼠(或乳鼠)。如此盲傳3代。6.4.2.1制備單層細(xì)胞：按常規(guī)法將傳代細(xì)胞(BHK-21、Vero或C6/36)分裝在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝細(xì)胞懸液5mL,細(xì)胞濃度應(yīng)為2×10?個(gè)/mL～3×10?個(gè)/mL,37℃培養(yǎng)48h。6.4.2.2接種細(xì)胞：5.3.2中采集的腦脊髓液和5.4.2中制備的上清液，或6.4.1.4中制備的鼠腦組織樣本離心后取上清液，接種BHK-21、Vero或C6/36傳代細(xì)胞。每份樣品接種2瓶細(xì)胞，另設(shè)對(duì)照細(xì)胞2液洗1次，再加入4mL細(xì)胞維持液。對(duì)照細(xì)胞不接種樣品，倒去營(yíng)養(yǎng)液后加4mL細(xì)胞維持液，37℃6.4.2.3觀察和記錄：若被檢樣品中含有JEV,通常在接種2d～3d后出現(xiàn)CPE,主要呈現(xiàn)細(xì)胞萎縮、6.4.2.4盲傳：如接種細(xì)胞第1代72h后未出現(xiàn)CPE,收獲細(xì)胞/病毒液按6.4.2.2所述方法再接種生長(zhǎng)48h的單層細(xì)胞進(jìn)行盲傳，即1mL第1代細(xì)胞/病毒液加4mL細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)。如此盲傳3代。對(duì)發(fā)病死亡的小鼠(或乳鼠)和出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)液，選用病毒RT-PCR檢測(cè)方法(第7章)通過(guò)核酸鑒定和分析進(jìn)行病毒鑒定。6.6.1小鼠(或乳鼠)盲傳3代無(wú)發(fā)病癥狀，細(xì)胞盲傳3代未見(jiàn)細(xì)胞病變，且經(jīng)6.5所述方法檢測(cè)陰性5GB/T18638—20216.6.2對(duì)發(fā)病死亡小鼠(或乳鼠)和出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)6.5所述方法檢測(cè)陽(yáng)性者，判定為JEV7病毒RT-PCR檢測(cè)方法7.1.2基因擴(kuò)增儀。7.1.5電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(或紫外透射儀)。7.1.7帶蓋的塑料離心管。7.1.8無(wú)RNA酶的離心管與吸頭。7.1.9PCR管。7.2試劑7.2.1.2酚氯仿抽提液：苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1)混合液。7.2.1.475%乙醇：無(wú)水乙醇(分析純)與DEPC水按3:1配制而成。7.2.1.5DEPC水：將DEPC按0.1%(體積分?jǐn)?shù))加入雙蒸餾水(ddH?O)配制而成。7.2.2RT-PCR試劑7.2.2.110×一步RNAPCR緩沖液。7.2.2.2逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV):5U/μL。7.2.2.4優(yōu)化的AMVTaq:5U/μL。7.2.2.6MgCl?:25mmol/L。7.2.3.1電泳緩沖液：50×TAE貯存液(見(jiàn)附錄A),臨用時(shí)加蒸餾水配成1×TAE緩沖液。7.2.3.4DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：分子大小范圍100bp～1000bp,100bp梯度。6GB/T18638—2021英砂研磨；然后加0.04mol/LPBS(pH7.4)(見(jiàn)附錄B中B.5)制成1:5的懸液；置4℃冰箱過(guò)夜，再于提取總RNA(冰上操作),再進(jìn)行定性RT-PCR,其擴(kuò)增產(chǎn)物可作為電泳陽(yáng)性對(duì)照樣品。7.4.1.1在核酸提取室操作。RNA提取使7.4.1.2取n個(gè)滅菌的1.5mL無(wú)RNA酶離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每7.4.1.3每管加入600μL變性液，再分別加入被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照各200μL,顛倒10次混7.4.1.512000r/min離心15min,棄去上清液，沿管壁緩緩加入0.8mL75%乙醇，顛倒3次～6次混—70℃冰箱保存。10×一步RNAPCR緩沖液2.5μLMgCl?(25mmol/L)5μLRNase抑制劑(40U/μL)0.5μLAMV(5U/μL)0.5μL優(yōu)化的AMVTaq(5U/μL)0.5μL擴(kuò)增程序設(shè)置如下：7GB/T18638—20217.4.3.1瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中，加熱融化后加5μL用適宜的梳子，待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒(méi)膠面。7.4.3.2加樣：取6pL～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2pL～3μL加樣緩沖液混勻后加入一個(gè)加樣孔。每次電泳至少加1孔陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照。同時(shí)加DNAMarker作分子量大小對(duì)照。7.4.3.3電泳：在電壓80V～100V或電流25mA～40mA條件下電泳10min。7.4.3.5DNA測(cè)序分析：將陽(yáng)性樣品PCR產(chǎn)物測(cè)序分析，驗(yàn)證陽(yáng)性樣品DNA條帶是否屬于流行性乙擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA條帶為430bp,與陽(yáng)性對(duì)照一致，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)條帶；且測(cè)序分析驗(yàn)證為流行8補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法8.1.3試管架。8.1.4水浴鍋(37℃~38℃)。8.2試劑8.2.2溶血素：效價(jià)大于1:5000。8.2.3補(bǔ)體：取3只～5只成年豚鼠新鮮血清混合而成。8.2.41%綿羊紅細(xì)胞懸液：采集適量健康綿羊抗凝血，加入2.5倍～3倍體積的阿氏液(見(jiàn)B.1),可放于4℃冰箱保存1個(gè)月。用時(shí)取適量綿羊紅細(xì)胞懸液，加入5倍～10倍體積的生理鹽水(見(jiàn)B.2),充分混勻，以2000r/min離心15min,棄上清液。如此洗滌3次。再加入5倍～10倍體積的生理鹽水懸浮紅細(xì)胞，充分混勻，以2500r/min離心15min,棄上清液，沉淀的紅細(xì)胞以生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液。8.2.5標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清。8.2.6標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清。8GB/T18638—20218.3被檢樣品8.3.1被檢血清：應(yīng)于發(fā)病早期和病后第4周各采血1次，無(wú)菌分離血清，密封裝入滅菌小瓶，2℃~8℃保存或-20℃長(zhǎng)期保存。操作過(guò)程中應(yīng)避免污染，且須保證血清新鮮透明不溶血。8.3.2滅活處理：試驗(yàn)前應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清及被檢血清進(jìn)行滅活。滅活時(shí)間均為30min。不同種類動(dòng)物滅活溫度存在差異，其中豚鼠56℃,馬58℃~60℃,人、猴及小鼠60℃,牛、水牛、山羊、狗、豬及倉(cāng)鼠62℃,騾和驢63℃~64℃,家兔65℃。8.4.1預(yù)備試驗(yàn)見(jiàn)附錄C。8.4.2.1.2將滅活后的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清及被檢血清分別進(jìn)行2倍連續(xù)系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)要大于其標(biāo)注效價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清一般作3個(gè)連續(xù)稀釋梯度。8.4.2.2.1取3排小試管，每排6支，按照擬加入的抗原類型均分為3組，即流行性乙型腦炎抗原組、正8.4.2.2.2將倍比稀釋的被檢血清分別加入到對(duì)應(yīng)的小試管中，具體操作程序見(jiàn)表1。8.4.2.2.3于各稀釋度的血清中分別加入0.1mL抗原，即流行性乙型腦炎抗原、正常對(duì)照抗原、鈣鎂溶液。8.4.2.2.4于各管中加入補(bǔ)體0.2mL。8.4.2.2.737℃水浴感作30min,而后對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。表1試驗(yàn)組滴加法試管號(hào)123456被檢血清血清稀釋度加入量/mL流行性乙型腦炎抗原(或正常對(duì)照抗原、鈣鎂溶液)加入量/mL補(bǔ)體加入量/mL第一次感作4℃冰箱過(guò)夜致敏綿羊紅細(xì)胞量/mL第二次感作37℃水浴30min結(jié)果判定示例十十十十十十十十十十十士十一9GB/T18638—20218.4.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：按照8.4.2.2操作進(jìn)行。8.4.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：按照8.4.2.2操作進(jìn)行。8.4.2.3.3血清抗補(bǔ)體稀釋對(duì)照：按照表2操作進(jìn)行。8.4.2.3.4紅細(xì)胞對(duì)照：按照表2操作進(jìn)行。8.4.2.3.5抗原對(duì)照：按照表2操作進(jìn)行。8.4.2.3.6補(bǔ)體對(duì)照：按照表2操作進(jìn)行。表2對(duì)照組滴加法對(duì)照組別不同稀釋度血清抗補(bǔ)體對(duì)照紅細(xì)胞對(duì)照抗原對(duì)照補(bǔ)體對(duì)照血清加入量/mL抗原加入量/mL稀釋液加入量/mL補(bǔ)體加入量/mL第一次感作4℃冰箱過(guò)夜致敏綿羊紅細(xì)胞量/mL第二次感作37℃水浴30min結(jié)果判定示例十十十十十十十十十十十十十十十一十十十十一8.5結(jié)果判定8.5.1判定標(biāo)準(zhǔn)：各對(duì)照組結(jié)果均成立時(shí)方可進(jìn)行結(jié)果判定，否則應(yīng)考慮重新采集血液或改用其他方法。各對(duì)照組結(jié)果如下：a)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：抑制溶血，結(jié)果與已知效價(jià)相差±1個(gè)滴度；b)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：100%溶血(一);c)血清抗補(bǔ)體對(duì)照組：100%溶血(一);d)紅細(xì)胞對(duì)照組：不溶血(十十十十);e)抗原對(duì)照組：不溶血(十十十十);f)補(bǔ)體對(duì)照組：50%溶血(十十)。8.5.2結(jié)果表示方法見(jiàn)C.3.2。血清效價(jià)以50%抑制溶血(++)為判定終點(diǎn)(溶血判定示意圖見(jiàn)圖D.1)。8.5.3結(jié)果判定：患畜恢復(fù)期血清比急性期血清的抗體滴度增長(zhǎng)4倍以上，可診斷為JEV感染病畜。單份血清抗體滴度1:16以上，結(jié)合臨床癥狀，可診斷為JEV感染病畜。1:4可作為馬騾感染的最低抗體滴度，重復(fù)試驗(yàn)仍達(dá)到1:4,結(jié)合臨床癥狀，可診斷為JEV感染病畜。9血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法9.1器材9.1.196孔V型微量血凝板。9.1.2多通道與單通道可調(diào)移液器及加樣頭。GB/T18638—20219.1.310mL無(wú)菌注射器。9.1.6普通低速離心機(jī)。9.1.7離心管。9.2試劑9.2.10.4%牛血清白蛋白pH9.0硼酸鹽緩沖液(BBS):見(jiàn)B.4。9.2.2pH6.4的磷酸鹽緩沖液(PBS):見(jiàn)B.5。9.2.325%的白陶土懸液：見(jiàn)B.6。b)加入高壓滅菌過(guò)后的PBS至2mL,用1mL移液槍輕輕將鵝紅細(xì)胞吹勻，500r/min,4℃離心棄上清液。重懸離心3次。放置于4℃冰箱備用。d)用1mL吸管在紅細(xì)胞泥中吸取所需的紅細(xì)胞，用pH6.4PBS配制8%的紅細(xì)胞懸液，余下的紅細(xì)胞泥放置于4℃冰箱備用。e)使用pH6.4PBS,將其作24倍稀釋，制成0.33%的工作濃度的鵝紅細(xì)胞懸液。此紅細(xì)胞懸液在4℃冰箱中儲(chǔ)存時(shí)間最長(zhǎng)為三周。在使用前，輕輕重懸紅細(xì)胞，再用于血凝抑制試驗(yàn)。取上清液，以鵝的紅細(xì)胞測(cè)定其血凝效價(jià)。用含0.4%牛血清白蛋白(BSA)的pH9.0硼酸鹽緩沖液(0.4%BBS)將JEV稀釋至8個(gè)血凝單位，4℃保存?zhèn)溆谩)室溫作用20min,間歇振搖。1000r/min,4℃離心30min,上清液即為10倍稀釋的血清。鵝紅細(xì)胞能充分吸附血清中非特異性的凝血因子，冰浴或4℃放置20min。800r/min,4℃離心10min,上清液即為處理好的待檢血清(1:10)。9.3.1在96孔V型板第2行至第8行滴加4%的BBS25μL/孔(按照表3操作進(jìn)行)。9.3.2在第1至11列的第1、2、8孔滴加處理好的血清25μL/孔，第2孔倍比稀釋至第7孔，棄去25μL(按照表3操作進(jìn)行)。9.3.3在第1至11列各孔加25μL8個(gè)血凝單位的乙腦病毒。第12列的第1、2孔加8個(gè)血凝單位的病毒，從第2孔倍比稀釋到第7孔，第8孔作為陰性對(duì)照孔；第12列的第1至第8孔各加25μL4%BBS,使整塊板的反應(yīng)體積達(dá)到50μL/孔。蓋上96孔板塑料蓋，將血凝板放置于室溫20min～30min(按照表3操作進(jìn)行)。9.3.4輕輕搖勻PBS稀釋好的鵝紅細(xì)胞懸液，每孔加入鵝紅細(xì)胞50μL,蓋上96孔板塑料蓋，再置室溫作用30min～45min或過(guò)夜后判定結(jié)果。GB/T18638—2021表3微量血凝試驗(yàn)孔號(hào)123456789病毒稀釋度1:2→1:4→1:8→1:16→1:32→1:64→對(duì)照生理鹽水加入量/mL病毒液加入量/mL0.5%紅細(xì)胞加入量/mL棄液體量/mL結(jié)果觀察十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十——9.4結(jié)果判定9.4.1判定標(biāo)準(zhǔn)9.4.1.1100%凝集(十十十十),呈薄膜狀，凝集顆粒均勻分布整個(gè)孔底。9.4.1.275%凝集(十十十),孔底有紅細(xì)胞呈滴狀，周?chē)研纬赡睢?.4.1.350%凝集(十十),血滴周?chē)心w粒，不呈膜狀。9.4.1.425%凝集(十),血滴周?chē)鷥H有少量凝集顆粒。9.4.1.50%凝集(一),呈圓滴狀沉淀于孔底，無(wú)凝集顆粒。參考判定標(biāo)準(zhǔn)(示意圖見(jiàn)圖D.2),患畜血清HI效價(jià)達(dá)到1:16,同時(shí)50%紅細(xì)胞發(fā)生凝集，判為JEV抗體陽(yáng)性。10間接ELISA抗體檢測(cè)方法10.1.1酶標(biāo)儀(含630nm濾光片)。10.1.2恒溫孵育箱。10.1.3多通道連續(xù)移液器(規(guī)格300μL)。10.1.5精確單道移液器(規(guī)格0.5μL～10μL、10μL～200μL和1mL～10mL)。10.1.6多道移液器(規(guī)格30μL～300μL)。10.1.7U底8×12孔血清稀釋板。GB/T18638—202110.1.9V底型加樣槽。10.1.10量筒(規(guī)格100mL和2000mL)。10.1.12一次性PE手套。10.2.6底物液A,見(jiàn)E.6。10.2.7底物液B,見(jiàn)E.7。采集動(dòng)物血時(shí)，每只動(dòng)物使用一個(gè)注射器。建議進(jìn)行前腔靜脈或耳靜脈無(wú)菌采血，不少于2mL。室溫靜置于斜面2h,待血液自然凝固后，置2℃~8℃冰箱中放置不少于2h,800r/min,4℃離心血清樣本若在一周內(nèi)檢測(cè)，可置2℃~8℃條件下保存。若超過(guò)一周檢測(cè)，應(yīng)置-20℃以下冷凍10.4.1JEV滅活抗原JEVSA14-14-2于單層BHK細(xì)胞上增殖，經(jīng)甲醛滅活后離心除去細(xì)胞碎片，收集上清液后采用硫酸銨法對(duì)病毒進(jìn)行濃縮，濃縮的病毒作為試驗(yàn)用抗原。采用方陣滴定方法，選應(yīng)的抗原稀釋度作為最終的使用濃度。10.4.2HRP標(biāo)記羊抗被檢動(dòng)物IgG將其用PBST稀釋至最適濃度。同待檢血清一起作同樣稀釋。10.5操作程序10.5.1抗原的包被：將滅活濃縮的乙腦病毒用包被液稀釋后加到96孔酶標(biāo)板中，100μL/孔，4℃放置拍干，共計(jì)洗滌3次。10.5.3封閉：加入封閉液100μL/孔，置37℃下溫育1h。10.5.5加入待檢血清：將待檢血清、陰性對(duì)照血清及陽(yáng)性對(duì)照血清用血清稀釋液按照1:40稀釋，將已稀釋血清各取100μL加至抗原包被板中，待檢血清設(shè)1孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)2孔。輕輕振勻孔中樣10.5.6洗滌：方法同10.5.2,共計(jì)洗滌5次。10.5.7加酶標(biāo)二抗：每孔加羊抗被檢動(dòng)物酶標(biāo)二抗100μL,置37℃下溫育30min。10.5.8洗滌：方法同10.5.2,共計(jì)洗滌5次。10.5.9加底物：每個(gè)反應(yīng)孔加入底物液A1滴(約50μL)和底物液B1滴(約50μL),混勻，置室溫避光顯色10min。10.5.10加終止液：待顯色結(jié)束后每個(gè)反應(yīng)孔中加入終止液1滴(約50μL),10min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。10.5.11結(jié)果測(cè)定：在酶標(biāo)儀上采用630nm處的吸光光度值(OD?30nm值)測(cè)定檢測(cè)結(jié)果。10.6結(jié)果判定值均應(yīng)<0.2。計(jì)算樣品的抗體陽(yáng)性；若S/P值<0.21,判為被檢動(dòng)物JEV抗體陰性。11間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)方法11.1器材11.2試劑11.2.2陰性和陽(yáng)性血清。11.2.3待檢血清。11.2.4緩沖甘油(見(jiàn)附錄F中F.1)。11.2.5異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記抗被檢動(dòng)物IgG(按說(shuō)明稀釋使用)。11.3操作程序11.3.1感染細(xì)胞的制備用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃和5%CO?環(huán)境中培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單GB/T18638—2021層時(shí)接種JEVSA14-14-2株，并換成含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36h～48h。11.3.2.1細(xì)胞病變(細(xì)胞圓縮、破裂)約達(dá)60%～80%時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，以1500r/min離心10min,棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀物3次，用PBS重懸細(xì)胞。11.3.2.3吹干滴好的抗原片，用4℃預(yù)冷的丙酮固定10min,保存于-20℃,一周內(nèi)使用。11.3.3.1取出抗原片室溫放置10min待用。11.3.3.2用PBS將待檢血清、陰性血清及陽(yáng)性血清分別稀釋成1:100和1:500兩個(gè)稀釋度，分別取11.3.3.4用PBS浸洗3次，每次10min。11.3.3.5取20μLFITC標(biāo)記的抗被檢動(dòng)物IgG滴加于上述處理過(guò)的抗原片各孔中，孵育同11.3.3.3,11.4.3陽(yáng)性對(duì)照血清：JEV感染細(xì)胞制備的抗原片中，加入陽(yáng)性血清，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)清晰的黃綠色熒光顆粒。12.1.1恒溫CO?培養(yǎng)箱。12.1.2倒置生物顯微鏡。12.1.396孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底)。12.1.5多道微量加樣器(10pL～100μL和30μL～300μL)及吸頭。12.2.1陽(yáng)性對(duì)照血清：JEV感染動(dòng)物或JEV疫苗免疫動(dòng)物血清，56℃水浴滅活30min。GB/T18638—2021備用。12.2.8細(xì)胞染色液：用10%福爾馬林配制成0.05%亞甲基藍(lán)溶液。12.3.1病毒增殖：在鋪滿BHK-21單層細(xì)胞接種JEV,置于37℃、5%CO?恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h后，加新鮮細(xì)胞維持液，再置37℃、5%CO?恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，待CPE達(dá)到75%以上時(shí)進(jìn)行病毒收獲。將收集的病毒在-70℃和4℃間反復(fù)凍融3次，無(wú)菌離心(2000r/min)20min,取上清液分鏈霉素)及5%血清的稀釋液將JEV作10-1、10-2、10-3、10-?、10-?及10-6稀釋，然后接種96孔微量板，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔25μL,每孔再補(bǔ)加25μL細(xì)胞生長(zhǎng)液。每孔加入BHK-21細(xì)胞懸液(使用濃度3.0×10?個(gè)/mL)50μL。同時(shí)設(shè)置8孔細(xì)胞對(duì)照，即用50μL細(xì)胞生長(zhǎng)液+50pLBHK-21細(xì)胞懸液。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于12.3.3病毒工作液的配制：將待檢病毒用細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋為每25μL含100個(gè)～1000個(gè)TCID?o作為病毒工作液。12.3.4血清準(zhǔn)備：陽(yáng)性血清、陰性血清和待檢血清經(jīng)56℃30min滅活后，自1:2倍比稀釋至1:32。12.4.1將10-1、10-2、10-3、10-4、10箱內(nèi)孵育1h或4℃冰箱孵育過(guò)夜。12.4.2將病毒和血清的混合液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組接種8孔，每孔50μL病毒和血清混合12.4.3置于37℃、5%CO?恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，并連續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)7d。12.4.4每次試驗(yàn)每塊培養(yǎng)板都應(yīng)設(shè)立下列對(duì)照：a)細(xì)胞正常對(duì)照：每塊培養(yǎng)板上均設(shè)立2孔～4孔不接種病毒的正常細(xì)胞對(duì)照，每孔分別加入50μL不含病毒的培養(yǎng)液和50μLBHK-21細(xì)胞；b)陰性對(duì)照血清：設(shè)8孔，每孔加入1:2或1:10稀釋的陰性血清和病毒混合液50μL,立即補(bǔ)c)陽(yáng)性對(duì)照血清：設(shè)8孔，每孔加入1:2或1:10稀釋的陽(yáng)性血清和病毒混合液50μL,立即補(bǔ)12.4.5染色：7d后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板固定并作常規(guī)染色。12.5.3陽(yáng)性對(duì)照血清：陽(yáng)性對(duì)照血清孔12.5.4病毒對(duì)照，應(yīng)保證在1000個(gè)TCID??的病毒液10-1和10-2稀釋度的各個(gè)孔均出現(xiàn)CPE,10-3有1個(gè)～3個(gè)孔出現(xiàn)CPE,10-?有8個(gè)孔全無(wú)CPE。GB/T18638—202112.6.1細(xì)胞層染色呈藍(lán)色為陽(yáng)性孔(病毒被中和),不著色為陰性孔(病毒未被中和),以血清能夠中和50%病毒時(shí)的稀釋度為血清最終滴度。12.6.2被檢血清最終滴度為1:4或更高者判定為陽(yáng)性。12.6.3被檢血清最終滴度低于1:4判定為陰性。12.6.4被檢血清最終滴度在1:2和1:4之間判定為可疑，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為1:4或更高時(shí)判定為13.1使用臨床診斷(第4章)可判定流行性乙型腦炎疑似感染，使用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法(第9章)或間接ELISA抗體檢測(cè)方法(第10章)或間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)方法(第11章)或病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)方法(第12章)可對(duì)疑似感染樣品進(jìn)行篩查，如需確診，可進(jìn)一步使用病毒分離鑒定(第6章)或病毒RT-PCR檢測(cè)方法(第7章)或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法(第8章)。13.2使用臨床診斷(第4章)可判定流行性乙型腦炎疑似感染，可使用病毒分離鑒定(第6章)或病毒RT-PCR檢測(cè)方法(第7章)或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法(第8章)確診流行性乙型腦炎病毒感染。13.3非免疫動(dòng)物流行性乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性排除母源抗體原因后可確診曾經(jīng)感染過(guò)流行性乙型腦GB/T18638—2021(規(guī)范性附錄)病毒RT-PCR檢測(cè)方法試驗(yàn)用試劑配制50×TAE:三羥甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸二鈉(Na?EDTA·2H?O)冰乙酸(C?H?O?)加去離子水至1000mL。242ggmLmLGB/T18638—2021(規(guī)范性附錄)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法用試劑配制B.1阿氏液(用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法)葡萄糖(C?H?2O?)2.05g檸檬酸鈉(Na?C?H?O?·2H?O)0.8g氯化鈉(NaCl)0.42g加雙蒸餾水或無(wú)離子水至100mL,56kPa20min高壓滅菌。B.2生理鹽水(用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法)氯化鈉(NaCl)8.5g加雙蒸餾水或無(wú)離子水至1000mL,105kPa20min高壓滅菌。B.3鈣鎂溶液(用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法)氯化鈣(CaCl?·2H?O)4.0g加蒸餾水至100mL,105kPa20min高壓滅菌。B.40.4%牛血清白蛋白pH9.0硼酸鹽緩沖液(BBS)(用于血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法)母液I:0.05mol/L硼砂(Na?B?O?·12H?O)溶液，硼砂5.2g,加雙蒸餾水或無(wú)離子水至250mL。母液：0.2mol/L硼酸(H?BO?)溶液，硼酸1.2g,加雙蒸餾水或無(wú)離子水至100mL。使用液：母液I132mL+母液IⅡ18mL+生理鹽水460mL。配制后測(cè)定pH值，如不到9.0,可加適量0.05mol/L硼砂溶液。105kPa20min高壓滅菌。臨用前，在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白。B.5不同pH值磷酸鹽緩沖液(PBS)母液I:1/15至1000mL。母液I:1/15mol/L磷酸氫二鈉(Na?HPO4)溶液，無(wú)水磷酸氫二鈉9.47g,加雙蒸餾水或無(wú)離子水mol/L磷酸二氫鉀(KH?PO?)溶液，磷酸二氫鉀9.08g,加雙蒸餾水或無(wú)離子水至pH5.8pH6.0PBS:母液I8.0PBS:母液I12.2mL+母液I92mL+生理鹽水566mL;mL+母液Ⅱ87.8mL+生理鹽水566mL;pH6.2PBS:母液I18.6mL十母液II81.4mL十生理鹽水566mL;pH6.4PBS:母液I26.7mL十母液IⅡ73.3mL十生理鹽水566mL;pH6.6PBS:母液I37.5mL+母液IⅡ62.5mL十生理鹽水566mL;pH7.4PBS:母液I80.8mL+母液I19.2mL十生理鹽水566mL。B.625%白陶土懸液(用于血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)方法)取優(yōu)質(zhì)白陶土粉末25g,加pH7.4磷酸鹽緩沖液至100mL,105kPa20min高壓滅菌4℃保存，可用1個(gè)月。臨用前搖勻。GB/T18638—2021(規(guī)范性附錄)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)方法的預(yù)備試驗(yàn)C.1溶血素效價(jià)滴定C.1.1溶血素的稀釋吸取溶血素0.1mL(含50%甘油者用0.2mL),加鈣鎂鹽水9.9mL(含50%甘油者加9.8mL),混勻后即為1:100的溶血素，然后取1:100溶血素1mL加鈣鎂鹽水4mL,即為1:500的溶血素。再按表C.1進(jìn)行稀釋。表C.1溶血素稀釋液制備管號(hào)溶血素濃度溶血素量/mL溶血素稀釋度溶血素最終濃度ABCDEFGHC.1.2溶血素的滴定后按表C.2依次加入補(bǔ)體、鈣鎂鹽水及1%綿羊紅細(xì)胞，搖勻后，置37℃水浴中30min,觀察結(jié)果。表C.2溶血素的滴定管號(hào)稀釋用補(bǔ)體濃度補(bǔ)體加入量/mL補(bǔ)體最終濃度124.03456789GB/T18638—2021能使紅細(xì)胞完全溶解的溶血素的最高稀釋度稱為1個(gè)溶血素單位。表C.1中的G管，即0.1mL1:6000的溶血素含有1個(gè)單位。試驗(yàn)中應(yīng)用2個(gè)單位的溶血素。即將溶血素稀釋成1:3000,則0.1mL中含有2個(gè)單位溶血素。C.2補(bǔ)體效價(jià)滴定即1:50稀釋補(bǔ)體。然后按表C.3的量，分別加入三排小試管中，再依次加入鈣鎂溶液、4個(gè)單位溶血素或1:5稀釋抗原，混勻后，放37℃水浴中30min,再加入致敏綿羊紅細(xì)胞(1%綿羊紅細(xì)胞懸液與等量2個(gè)單位溶血素相混合，放37℃水浴中15min),搖勻后，放37℃水浴中30min,觀察結(jié)果。表C.3補(bǔ)體效價(jià)的滴定抗原類型管號(hào)補(bǔ)體加入量/mL稀釋抗原加入量/mL鈣鎂溶液加入量/mL第一次孵育致敏紅細(xì)胞加入量/mL第二次孵育結(jié)果舉例病毒抗原10.050.25水浴中放置37℃水浴中不溶20.080.22微溶30.100.20微溶40.120.18全溶50.140.16全溶60.160.14全溶正常腦組織對(duì)照抗原70.050.25不溶80.080.22微溶90.100.20微溶0.120.18全溶0.140.16全溶0.160.14全溶鹽水對(duì)照0.050.35不溶0.08—0.32微溶0.100.30微溶0.120.28全溶0.14—0.26全溶0.160.24全溶C.2.2補(bǔ)體稀釋倍數(shù)的計(jì)算：能使紅細(xì)胞完全溶解的最小補(bǔ)體量為一個(gè)單位，正式試驗(yàn)和抗原滴定時(shí)都用2個(gè)補(bǔ)體單位。計(jì)算方法如下：0.12mL的1:50補(bǔ)體為1個(gè)單位，2個(gè)單位補(bǔ)體應(yīng)為0.24mL的1:50補(bǔ)體。補(bǔ)體稀釋倍數(shù)以