抗阿爾茲海默癥燈盞乙素苷元衍生物設計、合成及活性研究

背景介紹阿爾茲海默癥（AD）是一種漸行性神經(jīng)退行性疾病，是導致癡呆的主要原因。燈盞乙素及其活性代謝物燈盞乙素苷元（Scutellarein）具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、神經(jīng)保護、金屬螯合和抗炎特性，以及改善Aβ誘導的損傷等，表明燈盞乙素可能成為治療AD的有利藥物?；贏D這種神經(jīng)退行性疾病表現(xiàn)出復雜的發(fā)病機制表明，人們的注意力正轉向探索多靶點定向配體策略（MTDLs），即單個藥物分子可以同時與疾病病理相關的多個靶點結合并調節(jié)。本文亮點1、根據(jù)多靶點定向配體策略，以燈盞乙素苷元為骨架，通過不同的連接體，連接N，N-雙取代氨基甲酸酯片段和炔丙胺，N-甲基炔丙胺片段，設計并合成抗AD燈盞乙素苷元衍生物；2、基于AD的膽堿酯酶假說和單胺氧化酶假說，根據(jù)Ellama法和Holt法，進行酶活性測試，2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5，6-二羥基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯對兩種酶表現(xiàn)出較好的抑制活性；3、目標化合物可能是一個具有潛力的抗AD化合物，有待在抗氧化活性、金屬離子螯合、肝微粒體代謝等抗AD活性實驗中進一步研究。內容介紹1實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實驗步驟1.2.1

燈盞乙素苷元的制備3mol/L硫酸-95%乙醇溶液的制備：①先配制95%乙醇：取950mL的無水乙醇于1000mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻，裝入備用瓶。②取163mL(18.4mol/L)濃硫酸，少量多次加入到盛有上述95%乙醇的大燒杯中，勤攪拌，待冷卻后，轉移至1000mL容量瓶，用95%乙醇定容，搖勻備用。苷元的制備：取2.00g燈盞乙素于250mL的圓底燒瓶中，加入180mL的上述硫酸-乙醇溶液，80℃回流20h，至橘紅色澄清液體。反應結束后，倒入盛有2L冰水的大燒杯中，待沉淀析出完全后，抽濾，超純水反復洗滌濾餅至中性，用無水乙醇溶解并減壓旋干，得到黃色燈盞乙素苷元粗品，產(chǎn)率70%，直接用于下一步反應。1.2.2

二苯縮酮保護的燈盞乙素苷元的合成在250mL的干燥潔凈圓底燒瓶中，加入500mg(1.75mmol)燈盞乙素苷元，加入14mL二乙二醇二甲醚(DEME)將苷元溶解，加入251.6mg(1.75mmol)對二甲氨基吡啶(DMAP)，常溫攪拌下緩慢滴加二氯二苯甲烷，滴畢，將體系升溫回流反應2h。反應結束后，加入適量石油醚，待晶體析出完全后，去上清液，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離純化，洗脫劑為V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1：70，得橘黃色粉末，產(chǎn)率為65%。1.3

膽堿酯酶活性測試以及酶動力學測試采用Ellman法對目標化合物進行膽堿酯酶活性測試。96孔板中依次加入140μLPBS、20μL酶、20μL待測物或對照品(測試組),同時設置測試本底組(20μLPBS代替酶溶液)、空白組(20μLPBS代替待測化合物或對照品)、空白本底組(180μLPBS)。37℃培養(yǎng)20min后，依此加入現(xiàn)配的10μLDTNB和10μL的ATCI，每孔溶液總體積為200μL。37℃培養(yǎng)10min后，然后立刻使用酶標儀測試化合物在412nm處的OD值。每組數(shù)據(jù)重復做3次，取平均值。根據(jù)公式計算抑制率，用GraphPadPrism8.0計算出化合物抑制膽堿酯酶的IC50。抑制率(%)=[1-(OD測試組-OD本底組)/(OD空白組-OD空白本底組)]×100%1.4

單胺氧化酶活性測試1.5

化合物抑制/解聚Aβ1-42聚集活性實驗1.6

透射電鏡(TEM)觀察Cu2+誘導的Aβ1-42聚集/解聚2結果與討論2.1

酶活性測試結果如表1所示，所有的目標化合物對eeAChE均顯示了不同程度的抑制活性，IC50值范圍為3.50~12.69μmol/L，均優(yōu)于陽性藥，這表明N,N-雙取代氨基甲酸酯的引入是抑制膽堿酯酶活性的關鍵。其中化合物4b、4c、6a抑制作用較好，有待進一步的研究。2.2

酶動力學實驗結果基于上述結果，選擇化合物6a進行eeAChE動力學研究，結果如圖10a所示，eeAChE的Lineweaver-Burker圖中所有的直線在第三象限中相交于一點，隨著化合物(抑制劑)濃度的增加，斜率和截距都增加(即Vmax減少，Km增加)，這一結果表明，化合物對eeAChE抑制機理為混合型抑制。以Lineweaver-Burker圖中斜率對化合物濃度作圖，如圖10b所示，得抑制常數(shù)Ki值為3.61，表明化合物的抑制能力較強。2.3

抑制/解聚Aβ1-42聚集活性實驗結果如表2所示，所有化合物均有抑制Aβ1-42聚集的作用。除化合物4a、4b、4c外，其余6個化合物抑制Aβ1-42聚集的作用遠高于燈盞乙素和姜黃素。選擇化合物5a、5b、6a、6b進一步考察其抑制Cu2+誘導的Aβ1-42聚集，以及解聚自誘導和Cu2+誘導的聚集，結果如表2。化合物6a抑制自身誘導和Cu2+誘導的抑制率為87.57%和75.01%；化合物6a解聚自身誘導和Cu2+誘導的解聚率為82.22%和77.40%，均優(yōu)于燈盞乙素和姜黃素。2.4

透射電鏡(TEM)觀察Cu2+誘導的Aβ1-42聚集/解聚結果見圖11，未孵育過的Aβ1-42在電鏡下呈比較規(guī)整分散的圓形顆粒，Aβ1-42與Cu2+單獨孵育24h后聚集成不規(guī)則的纖維狀，Aβ1-42與Cu2+單獨孵育48h后聚集成不規(guī)則的纖維狀較24h更明顯。加入姜黃素和化合物6a后，聚集減少，且與化合物6a孵育的Aβ1-42聚集程度比與姜黃素孵育的Aβ1-42聚集程度明顯減少。表明化合物能夠有效抑制/解聚Cu2+誘導聚集，且抑制/解聚Cu2+誘導聚集的效果比姜黃素要好。透射電鏡結果與硫磺素T法測得的結果一致。3結論根據(jù)多靶點導向配體策略(MTDLs)，設計并合成9個雙靶點抗阿爾茲海默癥燈盞乙素苷元衍生物。結構通過1HNMR、13CNMR、ESI-MS進行確證，9個終產(chǎn)物(化合物4a~4c、化合物5a~5c、化合物6a~6c)總產(chǎn)率范圍在14.46%~19.37%之間?；贏D的膽堿酯酶假說和單胺氧化酶假說，根據(jù)Ellama法和Holt法，進行酶活性測試。結果表明，2-(4-((二甲基氨基甲?；?氧基)苯基)-5,6-二羥基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6a)對兩種酶表現(xiàn)出較好的抑制活性，對eeAChE的IC50為(5.06±1.59)μmol/L，對MAO-B的IC50為(23.61±0.27)μmol/L?；衔?a與eeAChE的酶動力學表明化合物6a對eeAChE是混合型抑制?；衔?a不僅對自身和Cu2+誘導的Aβ1-42聚集具