(高清版)GBT 39729-2020 細(xì)胞純度測(cè)定通 用要求 流式細(xì)胞測(cè)定法

ICS07.080細(xì)胞純度測(cè)定通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB/T39729—2020 I Ⅱ 3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ) 4方法原理 5通用要求 2 25.2儀器設(shè)備 5.3樣本制備 35.4試驗(yàn)步驟 5.5數(shù)據(jù)分析 55.6方法確認(rèn) 5 5參考文獻(xiàn) 6IGB/T39729—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提出并歸口。ⅡGB/T39729—2020細(xì)胞純度是評(píng)價(jià)和分析細(xì)胞樣本特性與細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量的基本參數(shù)，因此醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生物醫(yī)藥研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗(yàn)等領(lǐng)域需要廣泛開(kāi)展細(xì)胞純度的測(cè)量。流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)液體中懸浮單顆?；蚣?xì)胞進(jìn)行條件之間的數(shù)據(jù)一致性，需要對(duì)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞純度試驗(yàn)的技術(shù)環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化。1GB/T39729—2020細(xì)胞純度測(cè)定通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法本文件適用于研究、生產(chǎn)與檢驗(yàn)中通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)胞純度的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1目標(biāo)細(xì)胞celloftestingtarget3.1.2細(xì)胞純度cellpurity目標(biāo)細(xì)胞占樣本總細(xì)胞數(shù)量的百分率。3.1.3細(xì)胞特定成分與熒光染料或標(biāo)記了熒光染料的特異性抗體結(jié)合后進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。FSC:前向角散射光(ForwardScatter)SSC:側(cè)向角散射光(SideScatter)4方法原理使用流式細(xì)胞儀，通過(guò)總細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞不同的光學(xué)(散射光和熒光)特性，對(duì)待測(cè)樣本中的總細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。根據(jù)總細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞的測(cè)量數(shù)量，計(jì)算得到目標(biāo)細(xì)胞純度。2GB/T39729—20205通用要求選擇的熒光染料應(yīng)能被試驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀的激光器激發(fā)，其激發(fā)光信號(hào)能被流式細(xì)胞儀的檢測(cè)器接收。確保選擇的熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)目標(biāo)細(xì)胞具有特異性。要求。5.1.4緩沖溶液固定劑不應(yīng)造成待測(cè)細(xì)胞染色后的光學(xué)特性和形態(tài)嚴(yán)重改變。熒光補(bǔ)償樣品為單熒光染色細(xì)胞或者熒光補(bǔ)償微球。熒光補(bǔ)償樣品的熒光染料應(yīng)與待測(cè)細(xì)胞所用的熒光染料一致。熒光補(bǔ)償樣品的熒光強(qiáng)度至少要與待測(cè)細(xì)胞一致，或者超過(guò)待測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。5.2儀器設(shè)備具有熒光檢測(cè)通道和散射光檢測(cè)通道，熒光通道能夠檢測(cè)選擇的熒光染料，散射光檢測(cè)通道包括微量移液器量程為10μL～1000μL。微量移液器應(yīng)經(jīng)過(guò)檢定或校準(zhǔn)，并定期核查其移取量的準(zhǔn)確度和精密度。渦旋振蕩器使用的渦旋轉(zhuǎn)速不應(yīng)大于3000r/min。使用者應(yīng)監(jiān)測(cè)并記錄渦旋振蕩器的使用轉(zhuǎn)速、時(shí)長(zhǎng)等條件。3GB/T39729—2020的溫度準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。5.3樣本制備根據(jù)原始樣本的類型選擇合適的待測(cè)樣本制備方式。待測(cè)樣本應(yīng)是單分散細(xì)胞懸液，即待測(cè)樣本中的細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞存在，沒(méi)有細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞碎片。運(yùn)送條件不應(yīng)影響待測(cè)細(xì)胞的生物特性和檢測(cè)結(jié)果。5.3.3標(biāo)識(shí)待測(cè)樣本應(yīng)具有標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明樣本類型、樣本采集和制備的時(shí)間和地點(diǎn)。細(xì)胞染色前，應(yīng)根據(jù)流式細(xì)胞儀的性能參數(shù)、待測(cè)細(xì)胞的黏附、自然沉降等特性來(lái)調(diào)整樣本中的細(xì)胞濃度。如果細(xì)胞濃度過(guò)高，可用緩沖溶液對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)。根據(jù)熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體質(zhì)量參數(shù)確定樣本量及染料、抗體濃度、孵育條件。保證待測(cè)樣本和熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體充分混合，應(yīng)選擇合適的渦旋轉(zhuǎn)速和時(shí)長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成細(xì)胞破損。待測(cè)樣本完成細(xì)胞染色后，應(yīng)盡快進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。如果無(wú)法盡快上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)通過(guò)固定劑進(jìn)行固定并適當(dāng)條件保存，宜4℃~8℃避光保存。5.4試驗(yàn)步驟應(yīng)根據(jù)流式細(xì)胞儀的儀器說(shuō)明書(shū)設(shè)置儀器的工作條件，包括環(huán)境溫度、濕度、電源電壓、大氣壓力、環(huán)境光照等。5.4.2開(kāi)機(jī)校驗(yàn)每次開(kāi)機(jī)后，對(duì)流式細(xì)胞儀的光路系統(tǒng)進(jìn)行校驗(yàn)，可參考流式細(xì)胞儀的校驗(yàn)參數(shù)檢測(cè)FSC、SSC和各熒光通道的平均熒光強(qiáng)度、變異系數(shù)和熒光分辨率。案是否正確。使用不含任何熒光染料的待測(cè)細(xì)胞樣本作為陰性對(duì)照。使用已經(jīng)證明可有效地與待測(cè)熒光染料結(jié)合的細(xì)胞樣本作為陽(yáng)性對(duì)照。使用與熒光染料標(biāo)記的抗體相同種屬來(lái)源、同種免疫球蛋白的相同亞型的相同劑量抗體染色的細(xì)胞樣品作為同型對(duì)照。使用兩個(gè)和兩個(gè)以上的熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體組合標(biāo)記細(xì)胞樣本時(shí)，在完整的染色基礎(chǔ)上4CountCount使用減少一種熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞染色的待測(cè)細(xì)胞樣本作為熒光扣除對(duì)照。進(jìn)樣間隔期間，應(yīng)使用清洗液對(duì)儀器管道進(jìn)行清洗。選擇合適的檢測(cè)通道后，根據(jù)使用的熒光染料或相關(guān)試劑盒提供的質(zhì)量參數(shù)設(shè)置系列雙參數(shù)散點(diǎn)圖或單參數(shù)直方圖和閾值。根據(jù)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的FSC、SSC和熒光信號(hào)的強(qiáng)弱調(diào)整電壓大小。通過(guò)調(diào)整電壓使陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞FSC、SSC信號(hào)與細(xì)胞碎片或雜質(zhì)分開(kāi)處于對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖中部，見(jiàn)圖1。20002004006008001FSC圖1流式分析圖譜中細(xì)胞FSC/SSC信號(hào)示意圖通過(guò)調(diào)整電壓使陽(yáng)性對(duì)照的熒光信號(hào)處于雙參數(shù)散點(diǎn)圖(見(jiàn)圖2a)]中對(duì)應(yīng)熒光通道強(qiáng)度軸閾值的上方，或單參數(shù)直方圖[見(jiàn)圖2b]]中對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度軸閾值的右方；陰性對(duì)照的熒光信號(hào)處于雙參數(shù)散點(diǎn)圖中對(duì)應(yīng)熒光通道強(qiáng)度軸閾值的下方，或單參數(shù)直方圖中對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度軸閾值的左方，見(jiàn)圖2。CID3-KO400-400-300-Q12000C14-FITCa)雙參數(shù)散點(diǎn)圖b)單參數(shù)直方圖標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：Q1——陰性對(duì)照；圖2流式分析圖譜中陰性/陽(yáng)性對(duì)照的熒光通道信號(hào)類群區(qū)分示意圖采用兩種及以上染料組合方案進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)或光學(xué)檢測(cè)通道的電壓及增益發(fā)生變動(dòng)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行熒光補(bǔ)償。熒光補(bǔ)償樣品進(jìn)樣完成后，根據(jù)儀器操作軟件的指示進(jìn)行手工方式補(bǔ)償或自動(dòng)補(bǔ)償。5GB/T39729—20205.4.3.5目標(biāo)細(xì)胞設(shè)門(mén)使用同型對(duì)照和熒光扣除對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)相應(yīng)散點(diǎn)圖中的熒光強(qiáng)度表達(dá)，從陽(yáng)性對(duì)照的熒光信號(hào)中區(qū)分出目標(biāo)細(xì)胞的陽(yáng)性信號(hào)并進(jìn)行設(shè)門(mén)。5.4.3.6信號(hào)采集應(yīng)在進(jìn)樣穩(wěn)定后開(kāi)始采集信號(hào)?？偧?xì)胞信號(hào)采集數(shù)量不應(yīng)小于10000,目標(biāo)細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量不應(yīng)小于1000個(gè)。若總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量為10000時(shí)，不能獲取1000個(gè)目標(biāo)細(xì)胞采集數(shù)量，可加大總細(xì)胞信號(hào)采集數(shù)量。信號(hào)采集時(shí)間應(yīng)保持在合理范圍內(nèi)，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生聚集或沉降。5.5數(shù)據(jù)分析按照公式(1)計(jì)算目標(biāo)細(xì)胞純度： (1)P——目標(biāo)細(xì)胞純度；N,——目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量，單位為個(gè)；Nt——總細(xì)胞數(shù)量，單位為個(gè)。5.6方法確認(rèn)應(yīng)對(duì)具體測(cè)量方法進(jìn)行方法性能確認(rèn)。方法性能參數(shù)包括準(zhǔn)確度、精密度、工作范圍(檢出限、線性范圍等)、特異性、方法穩(wěn)健性和組間精密度(如操作者間、儀器間和日間變化)等。可建立評(píng)估方法性能參數(shù)的方案和標(biāo)準(zhǔn)，制定并保存相應(yīng)的文件。5.7報(bào)告報(bào)告提供的信息應(yīng)至少包括：a)使用儀器信息，包括儀器的參數(shù)設(shè)定；c)測(cè)量結(jié)果；d)數(shù)據(jù)分析程序；e)意外情況。6G