《儀器分析》課件-8高效液相色譜法

高效液相色譜法高效液相色譜儀01PARTONE第一節(jié)高效液相色譜儀

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入待分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來，由此得到液相色譜圖。貯液器高壓泵檢測(cè)器梯度淋洗裝置色譜柱壓力表進(jìn)樣器餾分收集器高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是儀器最重要的部件：由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器等組成。對(duì)高壓輸液泵的要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。1.高壓輸液系統(tǒng)

儲(chǔ)液罐：

材料應(yīng)耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）。溶劑約為0.5－2.0L。儲(chǔ)液罐放置位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差。使用過程儲(chǔ)液罐應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成的變化，還可防止空氣中氧氣、二氧化碳重新溶解于已脫氣的流動(dòng)相中。

對(duì)輸出流動(dòng)相的連接管路，其插入儲(chǔ)液罐的一端，通常連有孔徑為0.22μm的多孔不銹鋼過濾器或由玻璃制成的專用膜過濾器。

溶劑泵過濾高壓輸液泵泵體材料能耐化學(xué)腐蝕；能在高壓下連續(xù)工作；輸出流量范圍寬（0.1－10ml/min）；輸出流量穩(wěn)定。

常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重現(xiàn)性差它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵比恒壓泵優(yōu)越，使用較普遍通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置:

2．進(jìn)樣系統(tǒng)

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)流動(dòng)相入口色譜柱入口樣品出口樣品入口流動(dòng)相入口色譜柱入口樣品環(huán)進(jìn)樣器3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm。

對(duì)色譜柱的要求：柱效高，選擇性好，分析速度快等。

品牌填料C18/C8（直徑×長(zhǎng)度，粒徑）如：AgilentZorbaxSB-C18(4.6×250mm,5μm)使用色譜柱注意事項(xiàng)：1溶劑要脫氣，溶劑和樣品應(yīng)過濾,防止堵塞。2更換流動(dòng)相要漸變。3用后要保護(hù)好。4．檢測(cè)系統(tǒng)

HPLC與GC一樣，要求檢測(cè)器靈敏度高，重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，對(duì)溫度和流速的變化不敏感，應(yīng)用范圍廣，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)

檢測(cè)器分為兩大類：一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。

另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等?，F(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器。它的原理基于待測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外或可見光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關(guān)系服從朗伯-比爾定律。高效液相色譜檢測(cè)器：（1）紫外光度檢測(cè)器（UV）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，選擇性好，對(duì)流量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。最小檢測(cè)量10-9g·mL-1。缺點(diǎn)：只適用于檢測(cè)能吸收紫外、可見光的物質(zhì)，流動(dòng)相選擇受限制。要求流動(dòng)相在測(cè)定波長(zhǎng)下無吸收。

檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。它的作用原理是純流動(dòng)相與包含樣品的流動(dòng)相之間的折射率不同，檢測(cè)器把這種差值檢測(cè)出來，給出信號(hào)，信號(hào)的大小與樣品含量成正比。通用性強(qiáng)，不破壞樣品，線性范圍寬。主要缺點(diǎn)是靈敏度低，不適宜痕量分析。對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3）熒光檢測(cè)器（4）電導(dǎo)檢測(cè)器

（2）示差折光率檢測(cè)器

它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫一樣。

對(duì)于某些復(fù)雜樣品，組分的k′范圍很寬，用一種強(qiáng)度的溶劑淋洗時(shí)不能得到很好的分離，采用梯度淋洗。就是組成流動(dòng)相的兩種或兩種以上不同的溶劑按一定程序改變配比、極性、pH、離子強(qiáng)度、通過流動(dòng)相極性的變化來改變待分離樣品的選擇因子和tR，提高分離效果和分析速度。5、附屬系統(tǒng)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。溶劑過濾：選用水或油膜，0.22μm。

裝柱：分清正反，按照箭頭方向。打開儀器各部件：檢測(cè)正常。開計(jì)算機(jī)，打開工作站排氣：管路中無氣泡，甲醇或乙腈平衡色譜柱：半個(gè)小時(shí)。流動(dòng)相：平衡半個(gè)小時(shí)。進(jìn)樣：微量進(jìn)樣器，慢推快扳。洗柱：甲醇或乙腈半個(gè)小時(shí)，如用緩沖鹽，先用10％甲醇－水或10％乙腈－水沖洗一個(gè)小時(shí)，再換用甲醇或乙腈沖洗半個(gè)小時(shí)。關(guān)閉計(jì)算機(jī)和儀器混合樣品流動(dòng)相流動(dòng)方向ABCABC固定相

——柱內(nèi)填料流動(dòng)相——洗脫劑固定相流動(dòng)相流動(dòng)相安捷倫：Agilent沃特世：Waters戴安：Dionex島津：Shimadzu液相色譜中的固定相和流動(dòng)相02PARTTWO第二節(jié)高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相

（一）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。它是目前最廣泛使用的一種固定相。

硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

1.表面多孔型固定相

它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。

2．全多孔型固定相

它由直徑為10μm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.（二）流動(dòng)相

由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。

如：對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。（3）高純度。由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。

液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。流動(dòng)相組