豬德爾塔冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法

DB33/T2405—2021

豬德爾塔冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法

1范圍

本標準規(guī)定了豬德爾塔冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法的術(shù)語和定義、縮略

語、儀器、耗材和試劑、樣品采集和處理、熒光RT-PCR操作程序、結(jié)果判定及生物安全措施。

本標準適用于豬德爾塔冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

標準。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范

NY/T1948獸醫(yī)實驗室生物安全要求通則

SN/T4835實驗室生物廢棄物管理要求

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本標準。

3.1

RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reversetranscription-polymerasechainreaction），將RNA的反轉(zhuǎn)錄

(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。

4縮略語

下列縮略語適用于本標準。

β-Actin：肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白，其在不同物種之間高度保守，是PCR常用的內(nèi)

部參照。

Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cyclethreshold）。

DEPC：焦磷酸二乙酯（diethyipyocarbonate）。

DNA酶：脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）。

PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsolution）。

PDCoV：豬德爾塔冠狀病毒（porcinedeltacoronavirus）。

PEDV：豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）。

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RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）。

RNA酶：核糖核酸酶（ribonuclease）。

RT-EnzymeSolution：反轉(zhuǎn)錄酶溶液（reversetranscriptionenzymesolution）。

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）。

Taqman探針：一種檢測寡核苷酸的熒光探針。

TE緩沖液：Tris-EDTA緩沖液（tris-EDTAbuffer）。

5儀器

5.1熒光PCR檢測儀。

5.2高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃、離心速度可達12000r/min以上。

5.3組織研磨器或者研缽。

5.4分析天平。

5.5生物安全柜。

5.6冰箱：可溫控在2℃～8℃和-20℃～-40℃。

5.7超低溫冰箱：可控溫至-70℃以下。

5.8微量移液器：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭。

5.9高壓滅菌鍋和干燥箱：可溫控至160℃。

6耗材和試劑

6.1無RNA酶的1.5mL離心管。

6.2無RNA酶的0.2mLPCR管或八聯(lián)管及各種規(guī)格吸頭。

6.3除非另有說明，在檢測中使用的試劑均為分析純，實驗室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。

6.4Trizol：商品化RNA抽提試劑，2℃～8℃保存。

6.5RNA提取試劑盒：商品化RNA病毒核酸提取試劑盒。

6.6氯仿和異丙醇：-20℃預(yù)冷。

6.775%乙醇：無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。

6.8DEPC水：參照附錄A配制，也可購買商品化DEPC水。

6.9PBS（0.01mol/L，pH7.2）：參照附錄A配制，也可購買商品化PBS。

6.10引物和TaqMan探針：其序列見附錄B，由生物公司合成，用TE溶液溶解并稀釋至100μmol/L

存儲液，-20℃保存?zhèn)溆茫桓鶕?jù)需要配制成10μmol/L工作液，-20℃保存供檢測使用。

6.11病毒陽性對照和陰性對照：豬德爾塔冠狀陽性對照樣品和豬流行性腹瀉陽性對照樣品分別為攜帶

檢測靶序列的質(zhì)粒（質(zhì)粒及其檢測靶序列見附錄C），陰性對照樣品為空質(zhì)粒。

6.12內(nèi)參對照陽性對照樣品和陰性對照樣品：內(nèi)參對照陽性對照樣品為帶有豬β-actin基因的質(zhì)粒；

內(nèi)參對照陰性對照樣品為空質(zhì)粒。

7樣品采集和處理

7.1采樣工具

7.1.1手術(shù)刀、剪刀、鑷子，經(jīng)121℃濕熱滅菌30min。

7.1.2一次性無菌采樣拭子和采樣管。

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7.1.3組織研磨器或者研缽，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。

7.2樣品采集

7.2.1糞便或腸內(nèi)容物采集

將一次性無菌采樣拭子用無菌PBS浸濕后，蘸取糞便或腸內(nèi)容物（不少于0.5g），置于無菌采樣管

中備用。

7.2.2肛拭子采集

大豬使用保定器保定，小豬可以雙手保定，將一次性無菌采樣拭子用無菌PBS浸濕后，探入直腸2

cm～3cm、旋轉(zhuǎn)3次～5次后，取出含有直腸內(nèi)容物肛拭子，置于無菌采樣管中備用。

7.2.3組織樣品采集

用7.1.1處理過的器械，取腸道組織（不少于5g），置于無菌采樣管中備用。

7.3樣品保存和運輸

上述采集的樣品宜立即進行檢測。不能立即檢測的樣品，在2℃～8℃條件下保存不應(yīng)超過24h，

-25℃～-15℃條件下保存應(yīng)不超過1個月，-70℃以下條件保存應(yīng)不超過6個月。樣品運送采用低溫保

存進行運輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達。

7.4樣品處理

7.4.1糞便或腸內(nèi)容物

取0.5g～2.0g糞便或腸溶物加入500μL無菌PBS，凍融1次～2次，充分渦旋震蕩1min，于4℃下以

3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清裝于1.5mL滅菌管，用于后續(xù)的核酸提取。

7.4.2肛拭子

肛拭子采樣管中加入500μL無菌PBS，凍融1次～2次，充分渦旋震蕩1min，于4℃下以3000r/min

轉(zhuǎn)速離心5min，取上清裝于1.5mL滅菌管，用于后續(xù)的核酸提取。

7.4.3組織樣品

取1.0g～2.0g組織，剪碎，加入1mL無菌PBS進行研磨，制備組織勻漿，凍融1次～2次，于4℃下

以8000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清裝于1.5ml滅菌管，用于后續(xù)的核酸提取。

8熒光RT-PCR操作程序

8.1RNA提取

8.1.1按下列步驟完成RNA提取，并用無RNA酶活性的DNA酶處理，也可采用商品化的病毒RNA提取試劑

盒。

8.1.2取n個滅菌的1.5mL離心管（n為待檢樣品數(shù)），對每個離心管進行編號。

8.1.3每管加入750μLTrizol，加入被檢樣品250μL，用力上下反復(fù)顛倒數(shù)次或渦旋振蕩30s，靜置5

min。再加入200μL預(yù)冷的氯仿，震蕩混勻，靜置5min，于4℃條件下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心15min。

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8.1.4取與8.1.2中相同數(shù)量的滅菌1.5mL離心管，并對每個離心管進行編號。取8.1.3中離心后的上

清液（注意不要吸出中間層）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置30min。

8.1.5于4℃條件下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，棄上清，緩緩加入1mL75%預(yù)冷乙醇，顛倒洗滌沉

淀及管壁。

8.1.6于4℃條件下以12000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清，室溫條件下干燥后，加入30.0μLDEPC

處理水，輕輕混勻，溶解管中的RNA，以4000r/min轉(zhuǎn)速離心10s，置于冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應(yīng)在

2h內(nèi)進行熒光RT-PCR擴增，若需長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件的冰箱保存。

8.2熒光RT-PCR反應(yīng)

8.2.1反應(yīng)體系的配制

在試劑配制區(qū)分別配制病毒檢測反應(yīng)體系和內(nèi)參對照檢測反應(yīng)體系。病毒檢測反應(yīng)管數(shù)為n+3（n

為待檢樣品數(shù)，包括1份PEDV陽性對照、1份PDCoV陽性對照和1份陰性對照），反應(yīng)體系組成見下表1。

內(nèi)參對照檢測反應(yīng)管數(shù)為n+2（n為待檢樣品數(shù)，包括1份內(nèi)參對照陽性對照和1份內(nèi)參對照陰性對照），

反應(yīng)體系組成見下表2。各反應(yīng)液體積宜按多1管進行配制，且在使用RT-EnzymeSolution時至少用1μL。

配制反應(yīng)液應(yīng)在冰盒中進行。

表1PDCoV和PEDV雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系

組分1個檢測反應(yīng)的加入量/μL

2×RT-PCRReactionMix10.0

200×RT-EnzymeSolution0.1

PDCoV上游引物（PDVF）0.4

PDCoV下游引物（PDVR）0.4

PDCoV探針（PDVP）0.1

PEDV上游引物（PEDVF）0.4

PEDV下游引物（PEDVR）0.4

PEDV探針（PEDVP）0.1

DEPC處理水3.1

合計15.0

表2內(nèi)參對照熒光RT-PCR反應(yīng)體系

組分1個檢測反應(yīng)的加入量/μL

2×RT-PCRReactionMix10.0

200×RT-EnzymeSolution0.1

上游引物（ACTF）0.4

下游引物（ACTR）0.4

探針（ACTP）0.1

DEPC處理水4.0

合計15.0

8.2.2反應(yīng)液的分裝

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將8.2.1中配制的熒光RT-PCR反應(yīng)液充分混勻，按照每管15.0μL分裝于無RNA酶的0.2mLPCR管內(nèi)，

將PCR管置于96孔板上，按順序加樣并做好標識，轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)。

8.2.3加樣

在核酸提取區(qū)進行。按照陰性、樣品RNA溶液或陽性對照的順序加入各5.0μL溶液，蓋上蓋子，輕

微震蕩混勻，以500r/min～1000r/min轉(zhuǎn)速離心30s，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。

8.2.4上機檢測

8.2.4.1熒光通道設(shè)置

在檢測區(qū)進行。將8.2.3中離心后的PCR管放入熒光PCR檢測儀中，設(shè)定熒光檢測通道。其中，PDCoV

檢測通道為FAM，PEDV檢測通道為Cy3；內(nèi)參對照檢測通道為FAM。

8.2.4.2循環(huán)條件設(shè)置與檢測

反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性30s；然后95℃變性5s，60℃退火40s，共循環(huán)45

次，每次在60℃40s時收集熒光信號；最后40℃復(fù)性30s。檢測結(jié)束后，保存結(jié)果，根據(jù)收集的熒光

曲線和Ct值判定結(jié)果。

9結(jié)果判定

9.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性產(chǎn)品擴增曲線的最高點為

準。

9.2成立條件

9.2.1PDCoV陰性對照：FAM通道無報告Ct值或無典型的S型擴增曲線。PEDV陰性對照：Cy3通道無

報告Ct值或無典型的S型擴增曲線。

9.2.2PDCoV陽性對照：FAM通道Ct值≤30，且擴增曲線為典型的S型。PEDV陽性對照：Cy3通道Ct

值≤30，且擴增曲線為典型的S型。

9.2.3內(nèi)參對照陰性對照：FAM通道無報告Ct值或無典型的S型擴增曲線。

9.2.4內(nèi)參對照陽性對照：FAM通道Ct值≤30，且擴增曲線為典型的S型。

9.2.5內(nèi)參對照檢測：FAM通道Ct值≤33，且擴增曲線為典型的S型。

9.2.6檢測結(jié)果判定需同時滿足9.2.1～9.2.5。否則，本次檢測無效，應(yīng)重新進行。

9.3結(jié)果判定

9.3.1被檢樣品檢測結(jié)果中FAM通道Ct值＜35，且出現(xiàn)典型擴增曲線，報告為PDCoV核酸陽性。被檢樣

品檢測結(jié)果中Cy3通道Ct值＜30，且出現(xiàn)典型擴增曲線，報告為PEDV核酸陽性。

9.3.2被檢樣品檢測結(jié)果中FAM通道35≤Ct值≤37，且出現(xiàn)典型擴增曲線，報告為可疑，應(yīng)重復(fù)試驗。

重復(fù)試驗結(jié)果仍為可疑，報告為PDCoV核酸陽性，否則報告為PDCoV核酸陰性。被檢樣品檢測結(jié)果中Cy3

通道30≤Ct值≤32，且出現(xiàn)典型擴增曲線，報告為可疑，應(yīng)重復(fù)試驗。重復(fù)試驗結(jié)果仍為可疑，報告為

PEDV核酸陽性，否則報告為PEDV核酸陰性。

9.3.3被檢樣品檢測結(jié)果中FAM通道Ct值＞37，且無典型擴增曲線，報告為PDCoV核酸陰性。被檢樣品

檢測結(jié)果中Cy3通道Ct值＞32，且無典型擴增曲線，報告為PEDV核酸陰性。

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10生物安全措施

本標準中樣品的采集、處理、保存、運輸、檢測和廢棄物處理等涉及到的生物安全措施應(yīng)按照GB

19489、NY/T541、NY/T1948、SN/T4835等要求進行。

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附錄A

（資料性）

溶液配制

A.1DEPC水

每升去離子水中加入1mLDEPC，充分混勻，37℃放置12h以上，再經(jīng)121℃高壓滅菌15min后

備用。

A.2PBS（0.01mol/L，pH7.2）

用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4。用HCl調(diào)節(jié)溶液pH

至7.2，加水至1L。分裝后經(jīng)121℃高壓滅菌15min后備用。

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用800mL蒸餾水溶解至7.28，加水至gNaCl，10.2L。分裝后經(jīng)gKCl，1.44121g℃高壓滅菌Na2HPO4和0.2415mingKH后備用。2PO4。用HCl調(diào)節(jié)溶液pH

附錄B

（規(guī)范性）

引物和探針

引物、探針的名稱和序列見表B.1。

表B.1引物、探針的名稱與序列

檢測靶標名稱序列

上游引物（PDVF）5’-CGACCACATGGCTCCAATTC-3’

PDCoV下游引物（PDVR）5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’

探針（PDVP）5’-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-ZEN-3’

上游引物（PEDVF）5’-CGCAAAGACTGAACCCACTAACCT-3’

PEDV下游引物（PEDVR）5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT-3’

探針（PEDVP）5’-Cy3–TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC-BHQ2-3’

上游引物（ACTF）5’-CTCGATCATGAAGTGCGACGT-3’

內(nèi)參對照下游引物（ACTR）5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3’

探針（ACTP）5’-FAM-ATCAGGAAGGACCTCTACGCCAACACGG-TAMRA-3’

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附錄C

（規(guī)范性）

質(zhì)粒及其檢測靶序列

C.1質(zhì)粒

C.1.1質(zhì)粒基因組圖譜

對照樣品使用的質(zhì)?；蚪M圖譜見圖C.1。

圖C.1質(zhì)粒基因組圖譜

C.1.2質(zhì)粒序列

TGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAA

GGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTA

ATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGG

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ATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATA

CATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGAC

TGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGAC

ATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCC

TGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGC

TCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAA

AGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAACTCAAATCCTGCACAACAGATTCTTCATG

TTTGGACCAAATCAACTTGTGATACCATGCTCAAAGAGGCCTCAATTATATTTGAGTTTTTAATTTTTATGAAAAAAAAAAAAAAAAA

CGGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCG

CTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCA

TCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAATGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTTACTAAAAAGGGAATGTG

GGAGGTCAGTGCATTTAAAACATAAAGAAATGAAGAGCTAGTTCAAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAACTCCATGAAAGAAG

GTGAGGCTGCAAACAGCTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGCCTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGATTCAAGTAGAGGC

TTGATTTGGAGGTTAAAGTTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTATTGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTCACTACCCATT

TGCTTATCCTGCATCTCTCAGCCTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCTTAGAGATACCACCTTTCCCCTGAAGTGTTCCTTCCATGTTT

TACGGCGAGATGGTTTCTCCTCGCCTGGCCACTCAGCCTTAGTTGTCTCTGTTGTCTTATAGAGGTCTACTTGAAGAAGGAAAAACAG

GGGGCATGGTTTGACTGTCCTGTGAGCCCTTCTTCCCTGCCTCCCCCACTCACAGTGACCCGGAATCCCTCGACATGGCAGTCTAGCA

CTAGTGCGGCCGCAGATCTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAG

GCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAA

AGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCC

GACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG

TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGC

TGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGA

CTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCT

AACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGAT

CCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCC

TTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTC

ACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAA

TCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGA

GGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCC

GGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTT

CGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTC

CGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGA

AGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTG

TGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATAC

CGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA

TCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAA

GGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTA

TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAA

GTGCCACCTGACGTGGATCCCCTGAGGGGGCCCCCATGGGCTAGAGGATCCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAG

CCATGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGA

CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTA

CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG

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GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCC

CCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCT

ACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCC

AAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCA

TTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCC

ATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCCCTCGAAGCTTACATGTGGTACCGAGCTCGGATCCTG

AGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAG

TAACAGGGT