豬薩佩羅病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

DB32/TXXXX—2019I豬薩佩羅病毒檢測(cè)技術(shù)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬薩佩羅病毒的核酸檢測(cè)（RT-PCR法）、血清學(xué)檢測(cè)（間接ELISA方法）等要求。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的RT-PCR法適用于本病毒的抗原確診，間接ELISA試驗(yàn)適用于血清學(xué)的普查。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1豬薩佩羅病毒PorcineSapelovirus（PSV）單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科薩佩羅病毒屬。該病毒能引起中度或嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、腹瀉、繁殖障礙和肺炎，感染豬康復(fù)后仍然會(huì)繼續(xù)排毒，成為重要的病毒傳播源，因此該病毒在豬群中感染率很高，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。4核酸檢測(cè)（RT-PCR法）4.1材料準(zhǔn)備PCR引物P15`-GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC-3`和P25`-AATACAGGATGACACAGGAAGGG-3`（見(jiàn)附錄B）。PCR相關(guān)試劑。豬薩佩羅病毒陽(yáng)性病料RNA提取物反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為陽(yáng)性對(duì)照，水作為陰性對(duì)照。高速離心機(jī)（10000r/min）、PCR儀、電泳儀、水平電泳槽凝膠成像系統(tǒng)（或紫外投射儀）、移液器等儀器。4.2操作步驟4.2.1DNA模板制備按NY/T541規(guī)定的方法，采集待檢豬的病料置于-20℃以下冰箱保存。臨床組織病料樣品加入1×PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨后凍融3次，高速10000r/min離心5min，取上清提取病毒總RNA（參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書），并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒），保存?zhèn)溆谩?.2.2PCRPCR反應(yīng)體系：2xTaqMasterMix12.5μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，模板2μL～5μL，加ddH2O至總體積25μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，94℃30s，擴(kuò)增的退火溫度分別采用55℃進(jìn)行擴(kuò)增30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)72℃延伸10min。4.2.3電泳制備1%瓊脂糖凝膠，內(nèi)加適量溴化乙錠或其替代物，取PCR產(chǎn)物10μL～20μL分別與適量加樣緩沖液混合后，加樣到電泳孔中，9V/cm恒壓下電泳15min～30min。將電泳好的凝膠放到紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。4.3結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增到689bp條帶，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)條帶時(shí)，試驗(yàn)成立。在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品擴(kuò)增到689bp條帶，可確認(rèn)為樣品為豬薩佩羅病毒PCR陽(yáng)性。4.4廢棄物處理和防止污染的措施檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，應(yīng)做好無(wú)害化處理，檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施見(jiàn)附錄A。5血清學(xué)檢測(cè)（間接ELISA方法）5.1材料準(zhǔn)備豬薩佩羅病毒重組3C表達(dá)抗原，酶標(biāo)抗體，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，酶標(biāo)板及其他必要的試驗(yàn)溶液和酶標(biāo)儀、移液器等儀器。待檢血清樣品采集于疑似患病豬場(chǎng)。5.2操作步驟5.2.1包被：用包被液將豬薩佩羅3C蛋白抗原稀釋到工作濃度加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μL，4℃冰箱過(guò)夜。5.2.2洗滌：甩掉酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體，加入洗滌液200ul/孔，室溫下浸泡5min，甩去洗滌液，再重新加入洗滌液，連續(xù)洗3次，最后一次甩掉洗滌液后，拍干酶標(biāo)板。5.2.3封閉：各孔加入5%的脫脂乳封閉液200μL，37℃作用2h。按5.2.2步驟洗滌四次。5.2.4加入待檢血清和陰、陽(yáng)性血清對(duì)照：待檢血清用稀釋液1:320稀釋，每孔加100μL。同時(shí)將陰、陽(yáng)性血清作對(duì)照。37℃作用45min，重復(fù)5.2.2步驟，洗滌4次。5.2.5加入酶標(biāo)抗體：用稀釋液將酶標(biāo)抗體按1:10000稀釋，每孔加入100μL，37℃作用30min，重復(fù)5.2.2步驟，洗滌4次。5.2.6加入底物，每孔加100μL，室溫避光顯色8min。5.2.7終止反應(yīng)，每孔加入50μL終止液終止反應(yīng)。5.2.8測(cè)定光吸收值(OD)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(OD)。5.3結(jié)果判定用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，計(jì)算S/P值，S/P值=（樣品血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值）/（陽(yáng)性血清OD450nm值-陰性血清OD450n