內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷專家講座

Microvesiclesderivedfromendothelialprogenitorcellsprotectkidneyfromischemia-reperfusioninjurybymicroRNA-dependentreprogrammingofresidentrenalcell主講人：JACKY內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第1頁文件介紹起源：KidneyInternational;publishedonline11April2012.

作者：VincenzoCantaluppietal.科研機構(gòu)：UniversityofTorino,Torino,Italy.內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第2頁內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第3頁文件摘要內(nèi)皮前體細(xì)胞經(jīng)過旁分泌含有逆轉(zhuǎn)急性腎損傷作用。從前體細(xì)胞分泌微囊泡經(jīng)過mRNA水平轉(zhuǎn)移激活了內(nèi)皮細(xì)胞血管形成程序。微囊泡中RNA富含miRNA，這些miRNA能夠調(diào)整細(xì)胞增殖、促進血管形成、抗凋亡。缺血再灌注后，經(jīng)過靜脈注射微囊泡，這些囊泡主要集中在管周毛細(xì)血管、腎小管上皮細(xì)胞。經(jīng)過促進腎小管上皮細(xì)胞增殖，降低凋亡和白細(xì)胞浸潤對腎小管形態(tài)和功效保護。微囊泡也能經(jīng)過抑制毛細(xì)血管稀疏化、腎小球硬化和管周間質(zhì)纖維化來延遲緩性腎損傷進程。這些微囊泡保護作用在經(jīng)過RNase預(yù)處理、經(jīng)過敲除祖細(xì)胞Dicer基因來非特異性抑制祖細(xì)胞中miRNA產(chǎn)生、經(jīng)過轉(zhuǎn)染特異性miR-antagomirs來使促血管生成miR-126和miR-296表示降低。所以，內(nèi)皮祖細(xì)胞起源微囊泡經(jīng)過它們RNA成份來保護腎臟免受缺血造成急性損傷，這些RNA成份中miRNA有利于低氧環(huán)境下腎固有細(xì)胞開啟增殖程序。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第4頁EPC內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞(angioblast)，在生理或病理原因刺激下，可從骨髓動員到外周血參加損傷血管修復(fù)。1997年，Asahara等首次證實循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞,并將其命名為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。近年來研究顯示,內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮主要作用，并為缺血性疾病研究治療提供了新思緒。EPCs生物學(xué)特征和治療作用研究成為這一領(lǐng)域新熱點。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第5頁MVMicrovesicle（MV）是機體內(nèi)細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下都會分泌直徑在30~1000nm之間微小囊泡。多數(shù)研究者用MV來指代含有細(xì)胞間信號傳遞功效囊泡。細(xì)胞把特異生物活性分子如蛋白質(zhì)、miRNA等包裹到MV中，被運輸?shù)綄?yīng)受體細(xì)胞并調(diào)整受體細(xì)胞生物功效。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第6頁

EPC起源MV一些基本特征內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第7頁miRNA微小核糖核酸(microRNA，簡稱miRNA)，是一類非編碼由19-24個核苷酸組成小分子單鏈RNA,它們能夠與靶mRNA堿基互補配對而起作用，使mRNA降解或抑制其翻譯，從而參加各種主要生理和病理過程。miRNA可穩(wěn)定存在于血清血漿等體液中，有可能作為一個新生物標(biāo)志物用于臨床，有助診療疾病或者判斷疾病預(yù)后和復(fù)發(fā)情況，指導(dǎo)用藥和選擇治療方式。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第8頁miRNA產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運機制miRNA產(chǎn)生及其作用方式視頻內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第9頁試驗?zāi)繕?biāo)內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放微囊泡對腎臟急性缺血再灌注損傷動物模型是否有保護效應(yīng);微囊泡對低氧誘導(dǎo)腎臟上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護作用機制研究？內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第10頁試驗材料及方法Wistar雄性大鼠EPCs和fibroblast細(xì)胞RNase;siRNA;anti-miR-126antagomiRS;anti-miR-296antagomiRS;anti-Dicerpolyclonalantibody;內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第11頁試驗分組內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第12頁BioanalyzerRNAprofileEPCEPCMV內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第13頁miR-126andmiR-296含量比較EPCEPCMVFIBROFIBROMV內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第14頁經(jīng)過不一樣處理后miR-126和miR-296含量內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第15頁試驗過程1、按照分組制作模型，馬上尾靜脈注射MV?！?、試驗第二天，全部組，每組處死6只大鼠取樣本分析?！?、試驗第七天，全部組，每組處死6只大鼠取樣本分析?！?、試驗第180天，前四組，每組處死6只大鼠取樣本分析。IRI模型：右腎切除+左腎腎蒂夾閉45min。MV經(jīng)由尾靜脈注射，30微克。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第16頁試驗結(jié)果EPC起源MV和成纖維細(xì)胞起源MV特征及其比較EPC起源MV對腎臟缺血再灌注損傷保護作用EPC起源MV對體外培養(yǎng)低氧管周內(nèi)皮細(xì)胞（TEnCs）和腎小管上皮細(xì)胞(TEpCs)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第17頁EPC起源MV對腎臟缺血再灌注損傷保護作用血肌酐和尿素氮水平病理學(xué)形態(tài)檢驗細(xì)胞凋亡及增殖檢測長久影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第18頁血清肌酐和尿素氮內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第19頁MV注射后在體內(nèi)分布情況內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第20頁病理檢驗內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第21頁形態(tài)學(xué)評價內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第22頁細(xì)胞增殖率檢測（a、cBrdu；b、dPCNA）內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第23頁細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法）內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第24頁炎細(xì)胞浸潤內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第25頁長久結(jié)果（六個月后）內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第26頁小結(jié)以上試驗結(jié)果表明：EPC起源MV對IRI模型含有保護作用。能使血肌酐、尿素氮降低，細(xì)胞增殖加緊、凋亡降低。長久結(jié)果還能降低間質(zhì)纖維化，促進血管形成。去除MV中miRNA-126/296無此效果。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第27頁這些MV是到血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞呢如何定位？內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第28頁不一樣表面蛋白分子對MV內(nèi)化影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第29頁不一樣起源MV內(nèi)化區(qū)分內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第30頁mvproteinsurfaceexpressionEPC-derivedMVFibroblast-derivedMV內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第31頁proteinsurfaceexpression區(qū)分內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第32頁EPC-derivedMV對低氧環(huán)境培育TEnCs細(xì)胞凋亡、血管生成影響TUNEL法檢測TEnDs凋亡毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)檢測促血管生成作用內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第33頁EPC-derivedMV對低氧環(huán)境培育TEnCs促血管生成相關(guān)基因表示影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第34頁EPC-derivedMV對低氧環(huán)境培育TEpCs細(xì)胞凋亡影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第35頁EPC-derivedMV對低氧環(huán)境培育TEpCs凋亡相關(guān)基因表示影響內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第36頁內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第37頁結(jié)論注射含有miR126/296MV大鼠血肌酐和尿素氮水平顯著降低；顯著改進腎小球、腎小管和腎間質(zhì)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；能使小管壞死降低、管型生成降低；而且能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖；降低炎細(xì)胞浸潤。長久結(jié)果是：血肌酐水平下降，間質(zhì)纖維化降低和血管生成增多，不論是短期結(jié)果還是長久結(jié)果，都顯示出miRNA126/296對IRI模型形態(tài)學(xué)和功效學(xué)保護作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡腎臟缺血再灌注損傷第38頁L-selectin是介導(dǎo)MV內(nèi)化主要表面蛋白分子。含有miR126/296MV內(nèi)化后，能夠使凋亡相關(guān)基因表示下調(diào)，抑制上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管形成相關(guān)基因表示上調(diào)，促進血