中藥制劑的含量測定專家講座

第四章中藥制劑含量測定

藥品分析教研室中藥制劑的含量測定第1頁第一節(jié)含量測定目標與意義

在我國藥品質(zhì)量標準中，[判別]、[檢驗]和[含量測定]項目是判定中藥制劑質(zhì)量優(yōu)劣標準。中藥制劑判別是研究某種原料藥或成份存在是否，從而判定藥品真?zhèn)危繙y定項目是研究某種成份含量高低是否符合要求來判定藥品優(yōu)劣。中藥制劑含量測定是質(zhì)量控制中一項主要指標。經(jīng)過測定制劑中有效成份、毒性成份或一些指標性成份含量來衡量其制劑工藝穩(wěn)定性和中藥材質(zhì)量優(yōu)劣，以確保中藥制劑質(zhì)量，到達臨床用藥安全、有效和中藥制劑進入國際市場需要。

中藥制劑的含量測定第2頁第二節(jié)含量測定樣品處理

中藥制劑樣品基質(zhì)和成份組成十分復雜，而且樣品中被測成份往往含量較低，所以需要對樣品進行各種處理，使其符合所選定分析方法要求。樣品處理主要作用有：

將被測成份有效地從樣品中釋放出來，并制成便于分析測定穩(wěn)定試樣。

除去雜質(zhì)、純化樣品，以提升分析方法重現(xiàn)性和準確度。

富集濃縮或進行衍生化，以測定低含量被測成份。衍生化不但可提升檢測器靈敏度，還能夠提升方法選擇性。

使試樣形式及所用溶劑符合分析測定要求。

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一、樣品粉碎樣品粉碎有兩個目標：是確保含量測定所取樣品均勻而有代表性，提升測定結(jié)果精密度和準確度；是使樣品中被測組分能更加快地完全提取出來。粉碎時注意事項：不要粉碎得過細。樣品粉碎得過細，在樣品提取時，會造成過濾困難，所以可視實際情況進行粉碎過篩。防止污染樣品。在粉碎樣品時，要盡可能防止因為設備磨損或不潔凈等原因而玷污樣品，預防粉塵飛散或揮發(fā)性成份損失。過篩時，通不過篩孔部分顆粒決不能丟棄，必須重復粉碎或碾磨，讓其全部經(jīng)過篩孔。中藥制劑的含量測定第4頁第二節(jié)含量測定樣品處理

二、樣品提取對于中藥材和固體制劑樣品，在粉碎后，取粉末適量精密稱定，首先用溶劑進行提取，使被測組分和一些共存組分從中溶解出來（前者必須完全溶出），與濾渣分離后，再對被測組分進行含量測定。下面介紹幾個常見提取方法：冷浸法回流提取法連續(xù)回流提取法超聲提取法超臨界流體提取法中藥制劑的含量測定第5頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（一）冷浸法按所需準確度要求稱取一定量樣品置于帶塞容器內(nèi)，搖勻后放置，浸泡提取，溶劑用量為樣品重量10～50倍，并稱重。浸泡時間12～24小時，浸泡期間應注意經(jīng)常振搖，浸泡后再稱重，補足溶劑充分搖勻，浸泡后溶液，可取部分測定，也可全部測定。部分測定法（即等量法）是將浸泡后溶液，用適宜濾器過濾，精密量取一定量體積濾液，與一定重量樣品相當，進行測定。此法不宜揮發(fā)性較大提取溶劑。全部測定法（即總量測定法）是將浸泡后溶液濾過，濾渣充分用溶劑洗滌至提取完全，合并濾液及洗液，濃縮或蒸干得殘留物用另一溶劑溶解，定量轉(zhuǎn)入容量瓶，稀釋至刻度，搖勻，進行測定。此法可克服部分測定法缺點，且提取時溶劑用量無須精密加入。中藥制劑的含量測定第6頁（一）冷浸法另外全部測定法中提取液濃縮蒸干，可依據(jù)詳細情況采取以下方法：常壓或減壓蒸發(fā)，后者含有溫度低、速度快，適于對熱不穩(wěn)定樣品之優(yōu)點；自然揮散或氮氣流下吹干。適于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑，氮氣流能預防氧化；冷凍干燥（常為水溶液），更適于熱不穩(wěn)定樣品。冷浸法優(yōu)點是操作簡單，適于熱不穩(wěn)定樣品，且提取雜質(zhì)少。其缺點是費時、費溶劑。第二節(jié)含量測定樣品處理

中藥制劑的含量測定第7頁（二）回流提取法它是將冷浸法中帶塞容器換成回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱回流提取，其余操作方法同冷浸法。優(yōu)點：1、提取效率高于冷浸法；2、且可縮短提取時間，每次提取時間為0.5～2小時，直至提取完全為止。缺點：1、提取雜質(zhì)較多；2、該法對熱不穩(wěn)定或含有揮發(fā)性成份不宜使用。第二節(jié)含量測定樣品處理

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（三）連續(xù)回流提取法樣品置索氏提取器中，利用遇熱能夠揮發(fā)溶劑進行重復提?。ㄏ喈斢诳偸窃谑褂眯迈r溶劑提?。胀ㄌ崛?shù)小時方可完全。優(yōu)點：1）無需過濾，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶劑，再用適宜溶劑溶解，定容，進行測定。2）提取效率高，所需溶劑少，提取雜質(zhì)少，操作簡便。缺點：受熱易分解成份不宜使用。中藥制劑的含量測定第9頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（四）超聲提取法

樣品置適當容器中，加入提取溶劑，放入超聲振蕩器中進行提取。普通樣品30分鐘內(nèi)即可完成，最多不超出1小時。優(yōu)點：超聲提取能使樣品粉末更加好地分散于溶劑中提升提取效率和提取速度。（超聲助溶作用）缺點：促使化學反應發(fā)生（如氧化還原反應、大分子化合物降解和解聚合作用等）。

對于由浸膏制成固體制劑，用上述方法提取時，通常是精密稱取適量藥粉于量瓶中，定量加適當溶劑提取后，以干燥濾紙過濾，棄去濾液，取續(xù)濾液（預防濾紙吸附或污染被測組分），按部分測定法測定。中藥制劑的含量測定第10頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（五）超臨界流體提取法（Supercritical-fluidextraction,SFE）它是以超臨界流體（慣用CO2）作提取溶劑，有效、快速提取固體或半固體中被測成份樣品預處理新技術。超臨界流體（SF）是指高于臨界壓力（Pc）和臨界溫度（Tc）時所形成單一相態(tài)，它既不是液體，又不是氣體，而具以下特征：對樣品組分溶解能力強。超臨界流體（SF）密度與液體相近（如CO2超臨界流體密度為0.3～0.9g/cm3），而其含有與液體相同溶劑作用；2)有利于樣品中被測成份擴散進入SF中。SF粘度與氣體相近，比液體略低2個數(shù)量級，擴散系數(shù)卻比液體高1個數(shù)量級以上，使其含有良好傳質(zhì)性能；中藥制劑的含量測定第11頁3)

SF能使提取效率和提取速度大大提升。SF表面張力幾乎為零，而較輕易滲透進樣品基質(zhì)空隙中，有利于SF與樣品充分接觸；4)同一個SF在不一樣溫度和壓力下能夠提取極性或分子大小都不相同化學成份。SF密度、粘度和擴散系數(shù)等都與溫度、壓力和流體組成相關。溫度和壓力稍高于臨界點時，SF壓縮系數(shù)最大，壓力微小改變將造成較大密度改變，而控制密度就可控制SF對溶質(zhì)溶解能力，當前也慣用升壓力（即升密度）提取法進行分步提取。最慣用SF是CO2，它性質(zhì)穩(wěn)定，使用安全，價格低廉，臨界點低（Tc=31℃和Pc=7.4MPa），易于操作。

第二節(jié)含量測定樣品處理

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SFE含有優(yōu)點：速度快萃取效率高、方法準確度高、選擇性較高、節(jié)約溶劑、易于自動化，可防止使用易燃，有毒有機溶劑，能與色譜和光譜等分析儀器直接聯(lián)用特點。SFE不但慣用于熱不穩(wěn)定成份或揮發(fā)性成份萃取，而且也越來越多地用于熱穩(wěn)定性成份萃取。缺點：對設備要求高。中藥制劑的含量測定第13頁第二節(jié)含量測定樣品處理

三、樣品分離凈化（一）沉淀法原理：它是基于一些試劑與被測成份或雜質(zhì)生成沉淀，分離沉淀或保留溶液以得到精制方法。這種方法須注意：1）過量試劑若干擾被測組分測定，則應設法除去；2）大量雜質(zhì)以沉淀形式除去時，被測成份應不因產(chǎn)生共沉淀而損失；3）被測組分生成沉淀時，其沉淀經(jīng)分離后可重新溶解或直接用重量法測定。中藥制劑的含量測定第14頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（二）蒸餾法原理：利用一些被測成份含有揮發(fā)性，可采取蒸餾法，搜集餾出液進行含量測定，或一些成份經(jīng)蒸餾分解生成揮發(fā)性成份，利用分解產(chǎn)物（要求結(jié)構明確）進行測定。當前以水蒸氣蒸餾法應用較多。1）它可分為共水蒸餾法（即直接加熱法）、通水蒸汽蒸餾法和水上蒸餾法。如中藥制劑中揮發(fā)油，一些小分子生物堿（麻黃堿、於堿、檳榔堿）及丹皮酚等，都可用蒸餾法提取和分離凈化。2）為了使揮發(fā)性成份更完全地蒸餾出來，有時也可用鹽析作用，即在蒸餾液中加入一定量無機鹽，慣用NaCl、NaSO4、MgSO4等。中藥制劑的含量測定第15頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（三）液一液萃取法（LLE）

慣用兩種LLE方法是有機溶劑直接萃取法和離子對萃取法。⒈直接萃取法原理：利用試樣中被測成份與干擾成份在有機溶劑（萃取劑）中溶解度不一樣，經(jīng)過屢次萃取來到達分離凈化目標。屢次萃取即使有利于提升萃取回收率和結(jié)果準確度，但屢次溶液轉(zhuǎn)移等操作又會帶來誤差。有時對于組分復雜，含量低樣品，因為樣品數(shù)量多，屢次萃取費時等原因，只要每次測得回收率重現(xiàn)性好，常在可接收回收率前提下可采取單次提取。直接萃取法慣用溶劑有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯和乙醚等?？梢罁?jù)被測組分疏水性相對強弱來選擇極性適當溶劑，既確保被測組成充分萃取，又有很好選擇性。對于弱酸性成份應調(diào)整水相pH≤Ka-2。而弱堿性成份應調(diào)整水相pH≥PKa+2（此處為其共軛酸pKa），以使弱酸、弱堿性成份主要以非離子化游離酸、或堿形式存在，而提升萃取率。在提取過程中也常利用中性鹽鹽析作用，如水相用NaCl飽和，使被測組分進入有機相而提升提取率。

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⒉離子對萃取法：其原理是在適當pH介質(zhì)中，一些有機酸（堿）性物質(zhì)形成離子與帶相反電荷離子（也稱離子對試劑）定量地結(jié)合成為弱極性離子對，而易溶于有機溶劑，使之萃取分離。它最適合于高度電離有機酸、堿化合物萃取（不能用直接法萃?。?，在中藥制劑分析中主要用于生物堿（B）分析，其離子對試劑常為酸性染料（In-）如溴麝香草酚藍（BTB）和溴甲酚綠（BCG）等，在水相中定量反應為BH+（水相）+In_(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有機相）形成離子對BH+·In-慣用成氫鍵能力強氯仿或二氯甲烷提取。由上反應可知要求水相中生物堿和酸性染料都有較高離子化程度，所以必須注意水相pH和離子對試劑選擇。通常生物堿與BTB形成1∶1離子對，最好在pH5.2～6.4提取，而二元堿形成1∶2離子對，最好在pH3.0～5.8提取（二元堿堿性弱，需要在較低pH下離子化后形成離子對）。若氯仿層中微量水份引發(fā)渾濁，可經(jīng)過加入少許乙醇或久置分層變得澄清，也可分離有機相后加入脫水劑（慣用無水Na2SO4）或經(jīng)濾紙濾過除去微量水份，另外液一液萃取時應盡可能防止發(fā)生乳化現(xiàn)象。中藥制劑的含量測定第17頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（四）色譜法

吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜皆可作為中藥制劑分析中凈化分離方法，其操作方式有柱色譜，薄層色譜和紙色譜。其中經(jīng)典微柱色譜，也稱固相萃取或液—固萃?。↙SE）含有設備簡單，使用方便，快速，凈化效率較高而最慣用，將在此做一介紹。LSE通常是指樣品溶液加到裝有適當固定相（凈化劑）長5`～15cm，內(nèi)徑0.5～1cm色譜柱中，將被測成份保留于柱上，洗去雜質(zhì)后，再洗脫被測成份進行測定，或者是使雜質(zhì)強烈保留于柱上，直接洗脫被測成份進行測定。用這種選擇性好而柱效較低方法進行樣品凈化分離，尤其適合用于一類總成份含量測定，也可將色譜柱流出樣品深入用GC、HPLC、TCL分離后測定。LSE慣用凈化劑（填料）有氧化鋁、氧化鎂、硅藻土、硅膠、活性炭、大孔樹脂離子交換樹脂、鍵合相硅膠C8、C18、聚酰胺等。視其性質(zhì)可分為親脂型、親水型和離子交換型填料。中藥制劑的含量測定第18頁第二節(jié)含量測定樣品處理

⒈硅膠、氧化鋁等：

它們是傳統(tǒng)吸附劑，多以0.07～0.15mm(200～100目)顆粒1～5g用于樣品凈化處理，其作用機制為溶質(zhì)在吸附劑表面極性吸附作用。通常是當溶于有機溶劑樣品加到柱上時非極性或低極性雜質(zhì)先被洗出眾譜柱，再用適當極性溶劑洗脫被測成份，而強極性雜質(zhì)仍保留在柱上。氧化鋁能將黃酮類吸附在柱上，用于生物堿、苷類等測定。比如用ＵＶ法（吸收系數(shù)法）硅膠適合于分離中性或酸性化合物，強烈保留堿性化合物。若把樣品提取液加到柱上，依次用極性由小到大溶劑洗脫，則能夠?qū)㈦s質(zhì)和被測成份分離。另外，硅膠也和下面所述硅藻土等一樣，還可作親水型填料使用，常見商品硅膠柱為Sep-pakSilica，通常以甲醇、水處理后上樣。中藥制劑的含量測定第19頁⒉鍵合相硅膠：十八烷基鍵合相硅膠（簡稱C18或ODS）是慣用固體萃取劑，其次有烷基、苯基、氰基鍵合相硅膠，可用來分開脂溶性和水溶性雜質(zhì)或成份。也慣用于萃取，純化水基質(zhì)體液中憎水性藥品。該類LSE普通操作程序為：1)柱活化。用2ml甲醇沖洗以潤濕鍵合相和除去雜質(zhì)，再用0.5毫升水洗去柱中甲醇。2)上樣。3)清洗。用2～5ml水清洗以除去弱保留親水成份，如無機鹽、氨基酸、親水蛋白質(zhì)、糖以及中等保留成份極性化合物、低肽等。4)洗脫。用2～5ml甲醇或甲醇-水洗脫大分子肽、甾體、較親脂藥品等強保留待測組分。第二節(jié)含量測定樣品處理

中藥制劑的含量測定第20頁⒊大孔樹脂：它可分為極性和非極性型極性丙烯酰胺聚合物;非極性苯乙烯和二乙烯苯共聚物.其吸附性質(zhì)與烷基鍵合相硅膠相同，經(jīng)過疏水作用對非極性水溶性成份有吸附力。比如在測定復方歸芪劑中黃芪甲苷時，用大孔樹脂除去水溶性多糖雜質(zhì)，再用30%乙醇洗脫黃芪甲苷。大孔樹脂主要特點是表面主動大，傳質(zhì)速率較高和含有不一樣極性及適于吸附較大分子。樹脂在使用前需要前處理：用甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑除去雜質(zhì)，有時還需用酸、堿清洗。該填料用量常為1～2g，有時也用100～150mg來萃取血、尿中藥品，操作程序類似ODS填料。第二節(jié)含量測定樣品處理

中藥制劑的含量測定第21頁第二節(jié)含量測定樣品處理

⒋聚酰胺：它是慣用有機吸附劑，主要經(jīng)過與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用。慣用于含酚、酸、醌類藥品樣品液凈化分離，如測定黃酮時，用樣品乙醇提取液上柱，水洗去部分雜質(zhì)，以95%乙醇洗脫總黃酮后測定。

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⒌硅藻土、纖維素：

它們?yōu)閼T用親水型填料，其原理為分配作用。填料作為支持劑，多以水基質(zhì)液作為固定相，與水不混溶有機溶劑為流動相，較親脂成份從固定相轉(zhuǎn)移到流動相，而被洗脫，到達萃取目標。其萃取率較高（普通大于80%），無濃集作用，萃取液較純凈，但洗脫劑用量較大（普通大于5ml）硅藻土柱則用干柱直接上樣，柱可再生。常見牌號為Extretut。纖維素柱使用與硅藻土柱相同。中藥制劑的含量測定第23頁⒍離子交換樹脂：憎水基質(zhì)離子交換樹脂兼有離子交換劑及大孔樹脂一些性質(zhì)，所以對于在水中溶解度不大藥品、洗脫劑中需含一定量有機溶劑。離子交換樹脂柱可用于除去樣品中離子，預防組分分解，更慣用于萃取樣品液中可離解化合物。第二節(jié)含量測定樣品處理

中藥制劑的含量測定第24頁第二節(jié)含量測定樣品處理

另外，近年來發(fā)展起來固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技術有良好應用前景。SPME是一個無溶劑萃取技術，取樣方式有直接取樣和頂空取樣。中藥制劑的含量測定第25頁（五）消化法

對樣品進行有機破壞，慣用于中藥制劑中重金屬檢驗。慣用破壞方法有濕法消化和干法消化法。⒈濕法消化：依據(jù)所用試劑不一樣，下面介紹三種常見消化方法。（1）硝酸—高氯酸法該法破壞能力強，反應較激烈，故進行破壞時，必須嚴密注意切勿將容器中溶液蒸干，以免發(fā)生爆炸。本法適合用于血，尿、組織等生物樣品和含動植物藥制劑破壞，經(jīng)破壞后所得無機金屬離子均為高價態(tài)，本法對含氮雜環(huán)類有機物破壞不夠完全。（2）硝酸—硫酸法該法適合用于大多數(shù)有機物質(zhì)破壞，無機金屬離子均氧化成高價態(tài)，與硫酸形成不溶性硫酸鹽金屬離子測定，不宜采有此法。第二節(jié)含量測定樣品處理

中藥制劑的含量測定第26頁第二節(jié)含量測定樣品處理

（3）硫酸—硫酸鹽法本法所用硫酸鹽為硫酸鉀或無水硫酸納，加入硫酸鹽目標是為了提升硫酸沸點，以使樣品破壞加速完全。同時預防硫酸在加熱過程中過早地分解為SO3而損失。經(jīng)本法破壞所得金屬離子，多為低價態(tài)。本法慣用于含砷或銻有機樣品破壞，破壞后得到三價砷或銻。濕法消化所用儀器，普通為硅玻璃或硼玻璃制成凱氏瓶（直火加熱）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加熱）。所用試劑應為優(yōu)級純，水應為去離子水或高純水，同時必須按相同條件進行空白試驗校正。操作時應在通風櫥內(nèi)進行。

中藥制劑的含量測定第27頁第二節(jié)含量測定樣品處理

⒉干法消化

本法是將有機物灼燒灰化以達分解目標，將適量樣品置于瓷坩鍋、鎳坩鍋或鉑坩堝中，常加無水Na2CO3或輕質(zhì)MgO等以助灰化，混勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全即可。本法不適合用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等，）有機樣品破壞。應用本法時要注意以下幾個問題：1）加熱灼燒時，控制溫度在420℃以下，以免一些被測金屬化合物揮發(fā)。2）灰化完全是否，直接影響測定結(jié)果準確度。如欲檢驗灰化是否完全，可將灰分放冷后，加入稍過量稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振搖。若呈色或有不溶有機物，可于水浴上將溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼燒。3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時切勿棄去。中藥制劑的含量測定第28頁第三節(jié)慣用定量分析方法

分類重量分析和滴定分析?；瘜W分析法所用儀器簡單，結(jié)果準確。主要用于測定制劑中含量較高一些成份及含礦物藥制劑中無機成份，如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等?；瘜W分析法有一定不足，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時長，專屬性不高，對于微量成份準確性不理想。中藥制劑的含量測定第29頁第三節(jié)慣用定量分析方法（一）重量分析法重量法可分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。1、揮發(fā)法可測定含有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)組分含量。如：①供試品干燥失重測定；②水分測定均屬揮發(fā)法；③中藥制劑分析中灰分及熾灼殘渣測定等。2、萃取法是依據(jù)被測組分在互不相溶兩相中溶解度不一樣，到達分離目標。如①冰硼散中冰片含量測定；②地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定；③昆明山海棠片中總生物堿含量測定；④甘草浸膏中甘草酸含量測定即采取萃取法。3、沉淀法是將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，測定其含量方法，適合用于制劑中純度較高成份。如①西瓜霜潤喉片中西瓜霜含量測定；②苦參片中苦參總堿含量測定；③復方元胡注射液總堿測定。中藥制劑的含量測定第30頁第三節(jié)慣用定量分析方法（二）滴定分析法滴定分析法分為酸堿滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化還原滴定法。1、酸堿滴定法適合用于測定中藥制劑中所含有生物堿、有機酸、內(nèi)酯類等酸、堿組分含量。①直接滴定：對于K·C≥10-8酸、堿組分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘靈注射液中總生物堿含量測定、顛茄酊中生物堿含量測定。②間接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中總酸性物質(zhì)含量測定、草烏注射液中生物堿含量測定等。2、沉淀滴定法主要用于生物堿、生物堿氫鹵酸鹽及含鹵素其它有機成份含量測定。中藥制劑的含量測定第31頁第三節(jié)慣用定量分析方法3、配位滴定法包含EDTA法和硫氰酸銨法，在中藥制劑分析中，用以測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑含量。如①萬氏牛黃清心丸等含量測定就采取硫氰酸銨法；②牛黃解毒片中石膏含量測定。4、氧化還原滴定法適合用于測定含有氧化還原性物質(zhì)，如含酚類、糖類及礦物藥Fe、As等成份中藥制劑。如①磁朱丸中全鐵含量測定采取鈰量法；②牛黃解毒片中雄黃含量測定；③丹皮酚注射液中丹皮酚含量測。中藥制劑的含量測定第32頁第三節(jié)慣用定量分析方法二、可見一紫外分光光度法該法是中藥及其制劑含量測定一個慣用方法,含有靈敏度高，精度好和操作簡便等優(yōu)點。該法要求被測成份本身或其顯色產(chǎn)物對可見—紫外光含有選擇性吸收。按測定波長數(shù)目不一樣分為單波長光譜法和多波長光譜法。

中藥制劑的含量測定第33頁第三節(jié)慣用定量分析方法（一）單波長光譜法

分類方法特點吸收系數(shù)法測定所配供試品溶液在要求波長吸收度，依據(jù)被測成份吸收系數(shù)（E1%1cm）計算其含量①對儀器要求高，使用該法時，應注意儀器波長、空白吸收校正，吸收度準確度檢定和雜散光檢驗②無需對照品，方法簡便對照品比較法在一樣條件下配制對照品溶液和供試溶液，且使前者中所含被測成份量應為后者中被測成份量100%±10%，用要求波測定二者吸收度，則可計算出供試品中被測成份濃度或含量對儀器要求較高標準曲線法配制一系列不一樣濃度對照品溶液（常為5個），在相同條件下分別測定吸收度，繪制A-C曲線，或求出其回歸直線方程（相關系數(shù)r≥0.999），即得標準曲線。在相同條件下，測定供試品溶液吸收度，就可求得供試品中被測成份濃度或含量。①本法對儀器精度要求不高，有時標準曲線不經(jīng)過原點，只要重現(xiàn)性好也可使用②該法在比色法中最慣用中藥制劑的含量測定第34頁第三節(jié)慣用定量分析方法（二）多波長光譜法（計算分光光度法）

供試品溶液中若有各種（兩種或兩種以上）組分共存，其紫外光譜彼此發(fā)生不一樣程度重合時，則可經(jīng)過測定各種波優(yōu)點吸收度，依據(jù)吸收度加和性，采取適當數(shù)學處理方式進行多組分同時測定，或者用其排除共存組分干擾，測定其中某個組分。這就屬于多波長光譜法范圍。下面簡明介紹用多波長法測定存在光譜干擾多組分樣品中某個組分一些技術：雙波長法（包含等吸收點法和系數(shù)倍率法）、三波長法、導數(shù)光譜法和差示光譜法等。中藥制劑的含量測定第35頁第三節(jié)慣用定量分析方法1．基本原理

（1）．等吸收點法：設a、b分別為干擾組分和被測組分吸收曲線，λ2為測定波長（λS），λ1為參比波長（λR）。則有：①選擇λ1和λ2兩個基本條件：（i）干擾組分在λ1和λ2處應含有相同吸收度，即ΔAa=Aaλ2-Aaλ1=0，方便消除a干擾。（ii）待測組分ΔAb=Abλ2-Abλ1應足夠大，方便提升測定靈敏度和準確度。通常λ2選在bλmax附近。此法可消除在λ1～λ2區(qū)間內(nèi)，干攏組分吸收曲線為較寬吸收峰（谷）或為水平直線組分干擾。②定量公式△A=Aa+b–Aa+bλ1=△Aa+△Ab=△Ab=（Ebλ2-Ebλ1）·L·Cb=KCb即△A與Cb成線性關系，而與干擾組分濃度無關中藥制劑的含量測定第36頁第三節(jié)慣用定量分析方法（2）系數(shù)倍率法：

對于兩組分（a和b），若干擾組分在所選兩個波長區(qū)間沒有吸收峰或谷，或雖有吸收峰或谷，但被測組分b△A值太小時，可考慮用系數(shù)倍率法測定b組分。該法也適合用于特殊三組分體系。對于兩組分體系，選擇λ1和λ2條件是：①干擾組分△Aa=K2Aaλ2-Aaλ1=0，即K2=Aaλ1/Aaλ2。②被測組分△Ab=K2Abλ2-Abλ1足夠大。通常選擇K2>1，Abλ2>Abλ1時，測定靈敏度較高。于是定量公式為△A=K2Aa+b–Aa+bλ1=△Aa+△Ab=△Ab=（Ebλ2-Ebλ1）·L·Cb=KCb即△A與Cb成線性關系，而與干擾組分濃度無關。

中藥制劑的含量測定第37頁（3）三波長法：當干擾組分吸收曲線上有三點成線時，就可用三波長法消除干擾。用相同三角形等比性質(zhì)可推導出其定量公式為：△A=Aλ2-·C·L=KC三個波長選擇有等吸收點法和計算法（見第三版分析化學第13章），其標準是經(jīng)過粗略作圖和準確計算，使干擾組分吸收曲線上三點成線，即△A=O，而被測組分△A足夠大即可。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第38頁（4）導數(shù)光譜法：該法又稱微分光譜法，也是一個排除光譜干擾方法。其一階至四階導數(shù)光譜已均可在自動掃描分光光度計上直接掃描作出，而一階導數(shù)光譜在手動分光光度計上測定也較輕易。因為導數(shù)光譜含有給出信息量大，譜帶分辨率高和消除干擾能力強等優(yōu)點，所以在測試工作中日益受到重視。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第39頁第三節(jié)慣用定量分析方法從以上所述多波長光譜法原理可知，該法優(yōu)點是可省去或簡化樣品預處理步驟，測定組成已知復雜樣品，不過使用該法應慎重。首先因為中藥及其制劑供試品溶液往往組成復雜，甚至干擾組分或陰性空白樣品變動性大，所以，使得其方法適應性差，而只適應于同批樣品或內(nèi)控應用，當前極少在藥典和新藥報批中使用多波長法作為中藥制劑含量測定方法。再者，當測定吸收度處于吸收曲線陡峭部位時，波長微小變動可能對測定結(jié)果造成顯著偶然誤差。還有在實際工作中，因為測試條件改變，儀器精度與性能限制，多波長法不用吸收系數(shù)法，而采取標準品對比方法（慣用標準曲線法）來進行樣品測定。中藥制劑的含量測定第40頁第三節(jié)慣用定量分析方法2．測定步驟①UV光譜測定：它是指分別測定被測組分和干擾組分溶液UV光譜于同一坐標系中（即重迭掃描）。被測組分光譜通慣用純化學對照品配制成適當濃度溶液進行測定。對于干擾組分化學結(jié)構已知者，也可用純化學對照品測定其UV光譜，而對于干擾成份組成尚不清楚者，通慣用陰性樣品代替干擾成份來測定UV光譜。陰性樣品分為缺含被測成份藥材（即缺味）陰性樣品和缺被測成份陰性樣品。②波長選擇：它是指依據(jù)各種測定方法原理選擇一組適當波長。使得既能消除共存組分干擾，又能使被測組分測定靈敏度高（即回歸直線方程斜率大）和測定誤差小。中藥制劑的含量測定第41頁2．測定步驟③標準曲線繪制：通常按樣品測定條件，用標準品配制5～7種不一樣濃度溶液（必要時可加入干擾組分），分別測定各所選波優(yōu)點吸收度，然后計算其回歸直線方程（要求其相關系數(shù)r≧0.999）。④樣品測定：配制被測組分濃度處于標準曲線線性范圍內(nèi)樣品溶液（平行3～5份），測定各所選波優(yōu)點吸光度。按回歸直線方程和稀釋度計算樣品中被測組分濃度或含量。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第42頁第三節(jié)慣用定量分析方法計算分光光度發(fā)特點：在測定組成已知復雜樣品時，可省去或簡化樣品預處理步驟；中藥制劑分析中，干擾組分或陰性空白樣品變動性大，使得其方法適應性差，而只適應于一樣品或內(nèi)控應用；當測定吸收度處于吸收曲線陡峭部位時，波長微小變動可能對測定結(jié)果造成顯著偶然誤差；在實際工作中，因為測試條件改變及儀器與性能限制，多波長法慣用標準曲線法進行樣品測定。中藥制劑的含量測定第43頁第三節(jié)慣用定量分析方法（三）差示光譜法（ΔA法）特點：①簡易、快速、直接讀數(shù)；②不需事先分離，即能消除干擾，還可提升精密度與專屬性。方法：以試樣空白作參比溶液，經(jīng)過測定差示光譜中峰值（單波優(yōu)點）和振幅值（兩波優(yōu)點）進行定量分析。基本原理：①能提供一個適當參比溶液；②在兩種不一樣介質(zhì)環(huán)境或試驗條件下，被測組分有不一樣特征光譜，而賦形劑或其它共存組分光譜不變。定量依據(jù)：ΔA=A樣—A參=（Ab2+Aa2）—(Ab1+Aa1)=Ab2—Ab1=(Eb2—Eb1)·Cb·L=KCb中藥制劑的含量測定第44頁第三節(jié)慣用定量分析方法三、薄層掃描法

薄層掃描法是以薄層色譜法為基礎發(fā)展起來薄層色譜組分原位分析方法及薄層色譜統(tǒng)計方法，又稱薄層色譜掃描法（TLCS），對應儀器稱為薄層掃描儀（ThinLayerChromatogramScanner）。薄層掃描法是用一定波長光照射在薄層板上，對薄層色譜中吸收紫外光或可見光斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光斑點進行掃描，將掃描得到圖譜及積分數(shù)據(jù)用于藥品判別、雜質(zhì)檢驗或含量測定。中藥制劑的含量測定第45頁第三節(jié)慣用定量分析方法（一）基本原理

薄層掃描法是指薄層色譜斑點色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點移動，測定A-l或F-l曲線。依據(jù)薄層掃描測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。中藥制劑的含量測定第46頁第三節(jié)慣用定量分析方法1、薄層吸收掃描法基本原理：Kubelka-Munk理論及曲線。因為薄層板存在顯著散射現(xiàn)象，斑點中物質(zhì)濃度與吸光度關系需用Kubelka-Munk理論及曲線來描述。Kubelka-Munk理論以斑點相對反射率和相對透光率計算薄層色譜斑點吸光度，說明了固定相散射參數(shù)SX對斑點中物質(zhì)濃度與吸光度間關系影響，取得不一樣散射參數(shù)SX時斑點A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。光源：鎢燈和氘燈；靈敏度：在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇適當波長進行測定，其靈敏度可達ng級；適用范圍：適合用于在可見、紫外區(qū)有吸收物質(zhì)，及經(jīng)過色譜前或色譜后衍生成上述化合物樣品組分。中藥制劑的含量測定第47頁2、薄層熒光掃描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC光源：氙燈或汞燈。靈敏度：最低可測到10-50pg。適用范圍：適合于本身含有熒光或經(jīng)過適當處理后可產(chǎn)生熒光物質(zhì)測定。Kubelka-Munk理論不適合用于薄層熒光掃描，無需進行曲線校直。用薄層熒光掃描進行定量分析時，用斑點熒光強度積分值（色譜峰峰面積）與斑點中組分含量代替上式中F與C進行運算。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第48頁（二）薄層色譜規(guī)范化操作1、儀器與材料①薄層板；②涂布器；③點樣器材；④展開箱（層析缸）⑤顯色與檢測儀器2、操作方法①薄層板制備；②點樣；③展開；④檢測；第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第49頁第三節(jié)慣用定量分析方法（三）定量分析方法1、方法學考查新建薄層掃描定量方法必須進行方法考查，以說明新建方法可靠性，考查內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果精密度及準確度、統(tǒng)計檢驗等內(nèi)容。中藥制劑的含量測定第50頁（1）工作曲線

①檢驗所選擇散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校直為直線，不然，調(diào)整SX值再校正，直至在一定點樣量范圍內(nèi)工作曲線成直線為止。②考查工作曲線是否過原點，方便確定采取一點法或二點法定量。③確定點樣量線性范圍。既使采取曲線校直，也只是在一定點樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，所以需確定點樣量上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)整點樣量，使供試品與對照品峰面積相靠近。為了克服薄層板間差異，外標法及內(nèi)標法均應采取隨行標準法，即標準溶液與供試品溶液交叉點在同一塊薄層板上。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第51頁第三節(jié)慣用定量分析方法（2）精密度考查

取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點樣量平行點5點以上，展開后測定其峰面積，求算相對標準差（RSD），作為衡量定量分析結(jié)果精密度指標。RSD應小于4%。

式中：為n次測量平均值，S為標準差。中藥制劑的含量測定第52頁第三節(jié)慣用定量分析方法（3）準確度考查回收率是衡量定量方法準確度指標，慣用加樣回收率（R）來衡量，其值應在95-105%之間，測量數(shù)據(jù)普通為5-6個。將加入純品試樣溶液、供試品溶液及標準溶液點于同一塊薄層板上，展開后進行薄層掃描，測定各斑點峰面積，計算各溶液中組分量，計算回收率（R）。中藥制劑的含量測定第53頁（4）統(tǒng)計檢驗統(tǒng)計檢驗是檢驗兩種方法、兩臺儀器或兩個人測量兩組試驗數(shù)據(jù)精密度或準確度（偶然誤差或系統(tǒng)誤差）間是否存在顯著性差異，說明新建定量方法可否代替舊方法或優(yōu)于舊方法。統(tǒng)計檢驗包含F(xiàn)檢驗與t檢驗。

F檢驗即精密度差異檢驗，用以檢驗兩組數(shù)據(jù)精密度或偶然誤差是否存在顯著性差異，普通為單側(cè)檢驗。

t檢驗即準確度差異檢驗，用以檢驗兩組測量數(shù)據(jù)平均值或系統(tǒng)誤差是否存在顯著性差異。若t檢驗證實兩種方法測得均值不存在顯著性差異時，則新方法能夠代替舊方法，t檢驗普通為雙側(cè)檢驗。t檢驗與F檢驗詳細方法參見分析化學相關論著，此從略。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第54頁第三節(jié)慣用定量分析方法2、定量方法慣用定量方法有外標法、內(nèi)標法、追加法（疊加法）及回歸曲線定量法。（1）外標法外標法是薄層色譜掃描最慣用定量方法，方法簡便，但點樣必須準確。①外標一點法工作曲線經(jīng)過原點（截距為零）時可用外標一點法定量。只需點一個濃度標準品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計算公式為：C=F1·A式中：C為組分重量或濃度，A為測得該組分峰面積，F(xiàn)1為直線斜率或百分比常數(shù)。中藥制劑的含量測定第55頁②外標二點法工作曲線不經(jīng)過原點時，只能用外標二點法定量，最少需點二種不一樣濃度標準溶液（或一個濃度兩種點樣量），才能決定一直線,其計算公式為：C=F1A+F2式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線斜率或百分比常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動算出。

外標一點法、二點法只是指用一個或二種濃度標準溶液對比定量，為減小誤差，同一薄板上供試品點樣不得少于4個，對照品每一濃度不得少于2個；并調(diào)整標淮溶液濃度或供試品與標準溶液點樣量，使其峰面積相靠近；且點樣量必須準確，宜用定量毛細管點樣。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第56頁第三節(jié)慣用定量分析方法（2）內(nèi)標法內(nèi)標法是選一個純物質(zhì)作為內(nèi)標物，并準確稱取一定量內(nèi)標物加至供試液及標準液中，計算供試品溶液中某組分含量定量方法。

內(nèi)標物選擇要求是：純度合乎要求，展開后不得有雜質(zhì)斑點，不然內(nèi)標斑點峰面積將不能代表內(nèi)標物量。內(nèi)標物須為樣品中所不含有成份。內(nèi)標物不與其它斑點相重合，分離度合乎要求。為簡化計算，內(nèi)標物在標準溶液及供試品溶液中濃度應相等。中藥制劑的含量測定第57頁特點：1）在一定點樣量范圍內(nèi)，內(nèi)標法定量準確度與點樣量無關。2）不易找到適宜Rf值純品內(nèi)標物，且溶液配制等操作較麻煩。方法：1）內(nèi)標一點法：當工作曲線經(jīng)過原點時采取內(nèi)標一點法。內(nèi)標一點法公式：2）工作曲線不經(jīng)過原點時必須采取內(nèi)標二點法內(nèi)標二點法公式：

式中：C、Cis分別為組分及內(nèi)標物濃度或重量，A、Ais分別為測得組分及內(nèi)標物峰面積，F(xiàn)1為直線斜率或百分比常數(shù)，F(xiàn)2為截距，F(xiàn)1和F2由儀器自動計算并內(nèi)存，可直接給出樣品濃度或重量。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第58頁（3）回歸曲線定量法將不一樣濃度（或不一樣量）標準溶液與供試液點在同一塊薄層板上，展開、掃描;由計算機對所測得峰面積及對應點樣量進行線性或非線性回歸;直接由回歸方程或回歸曲線計算供試液含量方法;CAMAG系列薄層掃描儀即采取此方法。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第59頁第三節(jié)慣用定量分析方法（四）影響薄層色譜分析主要原因1、樣品預處理及供試液制備2、薄層色譜點樣技術3、吸附劑活性與相對濕度影響4、溶劑蒸氣在薄層色譜中作用5、溫度影響中藥制劑的含量測定第60頁相對濕度（%）所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）326810042571005839.510065341007227.51008810.889控制相對濕度用硫酸溶液第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第61頁第三節(jié)慣用定量分析方法四、氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體為流動相柱色譜分離分析方法。

特點：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點，兼具分離、分析功效，適合用于熱穩(wěn)定性好易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分分析。

適用范圍：適合用于熱穩(wěn)定性好易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分分析。中藥制劑的含量測定第62頁第三節(jié)慣用定量分析方法（一）基本原理

氣相色譜是依據(jù)汽化后試樣被載氣帶入色譜柱，因為各組分在兩相間作用不一樣，在色譜柱中移動有快慢，經(jīng)一定柱長后得到分離，依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質(zhì)量改變轉(zhuǎn)換成電信號改變統(tǒng)計成色譜圖，利用色譜峰保留值進行定性分析，利用峰面積或峰高進行定量分析方法。中藥制劑的含量測定第63頁1、塔板理論

將色譜柱柱效用理論塔板數(shù)n或理論塔板高度H衡量，取決于區(qū)域?qū)挾龋é?、W1/2、W），其計算公式為第三節(jié)慣用定量分析方法n=

=5.54

=16

H=L/n適中：tR為組分保留時間，σ、W1/2、W分別為組分標準差、半峰寬和基線寬度。中藥制劑的含量測定第64頁若以調(diào)整保留時間tR’代替tR，則得到反應色譜柱實際柱效有效理論塔板數(shù)neff。neff=

=5.54

=16

Heff=L/neff可見，當tR一定時，峰越窄，則H越小，n越大，柱效越高，分離性能越好。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第65頁2、速率理論速率理論研究了色譜過程中各種動力學原因?qū)χВǚ逭箤挘┯绊?，提出了VanDeemeter方程式：H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分別為渦流擴散項、分子擴散（縱向擴散）項、傳質(zhì)阻抗項，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最正確流速（Hmin）現(xiàn)象。速率方程式對于色譜分離條件選擇含有指導意義，它能夠說明色譜柱填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對柱效、峰擴張影響。對于開口毛細管柱色譜，渦流擴散項A=0，故VanDeemeter方程式可簡化為H=B/u+Cu，其傳質(zhì)阻抗小，柱長又遠遠大于填充柱，所以毛細管柱柱效要比填充柱高得多，其理論塔板數(shù)達105-106。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第66頁3、分離度計算分離度是衡量分離效果指標，以相鄰兩色譜峰峰尖距對峰寬均值倍數(shù)表示，其定義式為：兩峰基本分離，R≥1.5兩峰完全分離。分離度影響原因很多，可用基本分離方程式概括以下：a、b、c分別為柱效項，柱選擇性項和柱容量項。R==R=

abc第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第67頁4、系統(tǒng)適用性試驗按藥典標準，中藥制劑分析時，需按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，既用要求對照品對儀器進行試驗和調(diào)整，以到達要求要求；或要求分析狀態(tài)下色譜柱最小理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子。（1）色譜柱理論板數(shù)n在選定條件下，注入供試品溶液或各品種項下要求內(nèi)標物質(zhì)溶液，統(tǒng)計色譜圖，量出供試品主成份或內(nèi)標物質(zhì)峰保留時間tR和半峰寬Wh/2，按計算色譜柱理論板數(shù)。若測得理論板數(shù)低于各品種項下要求最小理論板數(shù)，應改變色譜柱一些條件（如柱長、載體性能、柱填充等），使理論板數(shù)到達要求。（2）分離度R定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其它峰或內(nèi)標峰之間有很好分離度，普通R≥1.5。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第68頁第三節(jié)慣用定量分析方法（3）重復性取各品種項下對照溶液，連續(xù)進樣5次，除另有要求外，其峰面積測量值相對標準偏差應小于2.0%，也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%對照品溶液，加入要求量內(nèi)標溶液，配成3種不一樣濃度溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其相對平均偏差也應小于2.0%。（4）拖尾因子T為確保測量精度，尤其當采取峰高法測量時，應檢驗待測峰拖尾因子T是否符合各品種項下要求，或不一樣濃度進樣校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：T=式中，W0.05h為0.05峰高處峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間距離，除另有要求外，T應在0.95-1.05之間。中藥制劑的含量測定第69頁第三節(jié)慣用定量分析方法（二）試驗條件選擇在氣相色譜分析中，為到達滿意分離效果，需依據(jù)VanDeemeter方程式和分離度方程式選擇適當分離條件，主要有固定相、柱溫、載氣流速等條件選擇。1、固定相選擇1）氣—液色譜①固定液：按極性相同、化學官能團相同相同性標準和主要差異選擇。②載體：普通為適宜粒度，經(jīng)酸洗并硅烷化處理硅藻土。2）氣—固色譜：固定相大多采取高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。中藥制劑的含量測定第70頁第三節(jié)慣用定量分析方法2、柱溫選擇選擇基本標準：在使最難分離組分有符合要求分離度前提下，盡可能采取較低柱溫，但以保留時間適宜及不拖尾為度。在實際工作中普通依據(jù)樣品沸點來選擇柱溫，詳細有以下幾點：高沸點樣品（沸點300-400℃），采取1-5%低固定液配比，柱溫200-250℃。沸點為200-300℃樣品，采取5-10%固定液配比，柱溫150-180℃。沸點為100-200℃樣品，采取10-15%固定液配比，柱溫選各組分平均沸點2/3左右。氣體等低沸點樣品，采取15-25%高固定液配比，柱溫選沸點左右，在室溫或50℃下進行分析。對于寬沸程樣品，需采取程序升溫方法進行分析。但需注意是柱溫要低于固定液最高使用溫度。中藥制劑的含量測定第71頁3、載氣選擇主要從對峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測器靈敏度影響三方面考慮。N2是最慣用載氣；載氣流速較低時，宜用N2；流速高時，宜用H2、He；較長色譜柱，宜用H2作載氣；熱導檢測器應選取H2、He；氫焰檢測器、電子捕捉檢測器，普通用N2；普通控制載氣流速高于其最正確流速。慣用載氣流速為20-80ml/min。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第72頁第三節(jié)慣用定量分析方法4、其它條件選擇氣化室（進樣口）溫度：氣化溫度取決于樣品揮發(fā)性、沸點范圍、穩(wěn)定性及進樣量等原因。檢測室溫度檢測器溫度普通需高于柱溫，以免色譜柱流出物在檢測器中冷凝而污染檢測器。通?？筛哂谥鶞?0℃左右或等于氣化室溫度。進樣量在檢測器靈敏度足夠前提下，盡可能降低進樣量，通常以塔板數(shù)下降10%作為最大允許進樣量。對于填充柱，氣體樣品為0.1-1μl，液體樣品為0.1-1μl，最大不超出4μl為宜。毛細管柱需用分流器分流進樣，分流后進樣量為填充柱1/10-1/100。另外，進樣速度要快，進樣時間要短，注意留針時間和室溫影響，以準確控制進樣量，以利于分離。中藥制劑的含量測定第73頁第三節(jié)慣用定量分析方法5、檢測器熱導檢測器（TCD）：通用型檢測器，應用廣泛，但靈敏度較低；氫焰離子化檢測器（FID）：應用最廣泛，適合用于含碳有機物測定，載氣多為N2。氮-磷檢測器（NPD）：專屬性檢測器，可用于中藥及其制劑中農(nóng)藥殘留量檢測。電子捕捉檢測器（ECD）：專屬性檢測器，適合用于痕量電負性有機物—如含鹵素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物分析。中藥制劑的含量測定第74頁第三節(jié)慣用定量分析方法（三）定量分析方法氣相色譜慣用定量方法有內(nèi)標法、外標法、歸一化法等。1、內(nèi)標法特點：為最慣用定量方法優(yōu)點：可抵消儀器穩(wěn)定性差、進樣量不夠準確等原因所帶來定量分析誤差；缺點：樣品配制較麻煩，有些內(nèi)標物不易尋找。關鍵：選擇適當內(nèi)標物。適用范圍：①適合用于樣品全部組分不能全部流出眾譜柱；②檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號；③只需測定樣品中某幾個組分含量時情況。中藥制劑的含量測定第75頁第三節(jié)慣用定量分析方法原理：選擇一內(nèi)標物，將一定量內(nèi)標物加入到樣品中，依據(jù)試樣重量W和內(nèi)標物重量Ws及待測組分和內(nèi)標物峰而積Ai、As，求出待測組分含量。待測組分百分含量為：Ci%=式中fi、fs分別為被測組分和內(nèi)標重量校正因子。在中藥制劑分析時，校正因子經(jīng)常不知，可采取藥典方法測定校正因子再用內(nèi)標法，或采取內(nèi)標對比法測定。中藥制劑的含量測定第76頁第三節(jié)慣用定量分析方法（3）內(nèi)標工作曲線法內(nèi)標工作曲線法與外標法相同，只是在各種濃度標準溶液中加入相同量內(nèi)標物，進樣，以標準物與內(nèi)標物峰面積比Ai/AS對Ci作工作曲線（或求回歸方程）樣品測定時也加入等量內(nèi)標物，依據(jù)樣品與內(nèi)標物峰面積比AX/AS由工作曲線求得待測組分含量。中藥制劑的含量測定第77頁第三節(jié)慣用定量分析方法2、外標法關鍵：①進樣量準確；②試驗條件恒定。分類：1）工作曲線法：用一系列濃度對照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準確進樣等體積樣品溶液，計算其含量；2）外標一點法：當工作曲線截距為零時，可采取外標一點法定量，中藥制劑的含量測定第78頁3、歸一化法關鍵：要求全部組分均要產(chǎn)生色譜峰。適用范圍：通常只能用于粗略考查供試品雜質(zhì)含量，普通宜用于微量雜質(zhì)含量檢驗.①校正面積歸一化法測定各組分含量。②面積歸一化法計算：中藥制劑的含量測定第79頁第三節(jié)慣用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎，引入氣相色譜理論和試驗方法。高壓輸送流動相，采取高效固定相及在線檢測等伎倆發(fā)展而來分離分析方法，含有分離效能高、分析速度快及應用范圍廣等特點。

適用范圍：適合用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子化合物分離分析。中藥制劑的含量測定第80頁第三節(jié)慣用定量分析方法（一）HPLC基本原理

HPLC與GC主要差異是流動相性質(zhì)不一樣。1、塔板理論用于計算理論塔板數(shù)及理論塔板高度，衡量色譜柱柱效。在系統(tǒng)適用性試驗中，其理論板數(shù)不得低于各品種項下要求最小理論板數(shù)。H=L/n中藥制劑的含量測定第81頁第三節(jié)慣用定量分析方法2、速率理論在HPLC中流動相為液體。粘度大柱溫低，擴散系數(shù)Dm很小，所以縱向擴散項B/u可忽略不計，其速率方程式為：H=A+CuC=Cm+Csm+Cs式中Cm、Csm、Cs分別是組分在流動相、靜態(tài)流動相和固定相中傳質(zhì)阻抗系數(shù)。對于化學鍵合相色譜，“固定液”是被鍵合在載體表面單分子層，Cs≈0，則C=Cm+Csm。在HPLC中，當流動相線速度大于1cm/s時，可近似認為流動相流速與板高成直線關系，為兼顧柱效與分析速度，普通都采取較低流速。內(nèi)徑2-4.6mm色譜柱，多采取1ml/min。中藥制劑的含量測定第82頁第三節(jié)慣用定量分析方法（二）HPLC試驗條件選擇1、色譜柱選擇依據(jù)被分離物質(zhì)化學結(jié)構、極性和溶解度等原因進行選擇。①大多數(shù)藥品可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；②也可選取正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；③解離藥品可用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；④脂溶性藥品異構體分離測定可采取硅膠吸附色譜柱。中藥制劑的含量測定第83頁第三節(jié)慣用定量分析方法2、流動相選擇1）反相鍵合相色譜流動相慣用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥品非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特征化合物反相鍵合相色譜慣用流動相中藥制劑的含量測定第84頁第三節(jié)慣用定量分析方法2）正相鍵合相色譜

①常采取飽和烷烴（如正已烷）中加入一個極性較大溶劑作為極性調(diào)整劑（如異丙醚），經(jīng)過調(diào)整極性調(diào)整劑濃度改變?nèi)軇姸龋?/p>

②常采取二元以上混合溶劑系統(tǒng)。中藥制劑的含量測定第85頁第三節(jié)慣用定量分析方法3、洗脫方式

等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，使全部組分k值都處于這個范圍內(nèi)，適合用于組分數(shù)較少、性質(zhì)差異不大樣品。

梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相組成（如溶劑極性、離子強度和pH值等），適合用于分析組分數(shù)多、性質(zhì)相差較大復雜混合物樣品，從而使全部組分都在適宜條件下取得分離。中藥制劑的含量測定第86頁4、檢測器

檢測器特點最低檢測限適用范圍紫外檢測器（UV或UVD）分為:①可變波長型②二極管陣列檢測器①用于檢測有外吸收物質(zhì);②靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度波動不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基和羧基化合物等熒光檢測器(FD)①用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光物質(zhì);②靈敏度高于紫外檢測器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)①屬通用型檢測器,理論上可用于揮發(fā)性低于流動相任何樣品組分;②檢測靈敏度較低,適適用于流動相能揮發(fā)色譜洗脫,不能用含緩沖鹽流動相用于檢測糖、高分子子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物中藥制劑的含量測定第87頁4、檢測器

電化學檢測器(ECD)用于能氧化、還原有機物質(zhì)檢測1×10-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測器(RID)①屬通用型檢測器,利用組分與流動相折射率之差進行檢測.②穩(wěn)定性好,操作方便.③靈敏度低,受環(huán)境溫度、流動相組成等波動影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類檢測化學發(fā)光檢測器(CLD)①高選擇性、高靈敏度新型檢測器.②設備簡單,本身發(fā)光,無需光源,價格廉價Pg級(10-12)用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺等中藥制劑的含量測定第88頁5、HPLC前處理（1）流動相處理

①溶劑純化選擇專供色譜分析用“色譜純”溶劑，分析純或優(yōu)級純?nèi)軇┰诤芏嗲闆r下也可滿足色譜分析要求。因為不一樣色譜柱和檢測方法對溶劑要求不一樣，有時需進行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。水普通采取石英系統(tǒng)二次蒸餾水。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第89頁②流動相脫氣HPLC所用流動相必須預先除去其中空氣，習稱脫氣，普通在臨用前對流動相進行脫氣，慣用脫氣法有超聲波振蕩脫氣、惰性氣體（He）鼓泡吹掃脫氣、抽真空加熱法。③過濾過濾是為了預防不溶物堵塞流路和色譜柱入口處微孔墊片，所以應預先除去流動相中任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而慣用方法是過濾，采取0.45μm以下微孔濾膜過濾。濾膜分有機溶劑專用和水溶液專用兩種。第三節(jié)慣用定量分析方法中藥制劑的含量測定第90頁第三節(jié)慣用定量分析方法（2）樣品處理HPLC分析前需對樣品進行預處理，方便將待測物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，使樣品形式及所用溶劑符合HPLC要求。①待測組分提取依據(jù)樣品成份及組分性質(zhì)選擇適當提取方法和提取條件。②溶劑揮發(fā)對于液體樣品或經(jīng)處理后得到樣品溶液，若待測物濃度在定量限以上，且溶劑對HPLC系統(tǒng)沒有干擾，能夠直接進樣分析。但很多情況下需除去溶劑，濃縮甚至干燥樣品，除去溶劑方法有：自然揮散或在氮氣流下吹干，適合用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；減壓蒸發(fā)，適合用于熱不穩(wěn)定樣品；冷凍干燥，適合用于受熱易分解破壞樣品。③濾過樣品溶液進樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。中藥制劑的含量測定第91頁第三節(jié)慣用定量分析方法其中液-液分配色譜是中藥制劑分析中應用最廣泛方法，依據(jù)固定相與流動相極性差異，分為正相色譜和反相色譜兩類。正相色譜:流動相極性小于固定相極性分配色譜法，主要用于極性物質(zhì)分離測定；反相色譜:流動相極性大于固定相極性分配色譜法，主要用于非極性、中等極性物質(zhì)分離測定中藥制劑的含量測定第92頁第三節(jié)慣用定量分析方法化學鍵合相是將固定液官能團鍵合在載體上所形成固定相。含有化學性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，普通在pH2-8范圍溶液中不變質(zhì)，使用過程不流失，載樣量大，適于梯度洗脫等特點，已廣泛用于正相與反相色譜，離子抑制色譜，離子對色譜。藥典中HPLC法所采取固定相均為化學鍵合相。以化學鍵合相為固定相色譜法稱為化學鍵合相色譜法.現(xiàn)就中藥制劑分析中最慣用鍵合相色譜法作一介紹。中藥制劑的含量測定第93頁第三節(jié)慣用定量分析方法（1）反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法是當代液相色譜中應用最為廣泛方法，占整個HPLC應用80%左右。反相色譜法普通采取非極性鍵合相，十八烷基鍵合相（簡稱ODS或C18）是最慣用非極性固定相，對于各種類型化合物都有較強適應能力；流動相通常以水為基礎溶劑，再加入一定量能與水互溶極性調(diào)整劑，慣用有甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)。極性調(diào)整劑性質(zhì)及其與水混合百分比對溶質(zhì)保留值和分離選擇性有顯著影響，流動相極性增大，洗脫能力降低，溶質(zhì)k增大，tR增大；反之，k與tR減小。調(diào)整流動相極性，可控制k值在所要求范圍內(nèi)（k=1-10），對于結(jié)構類似組分，極性大組分先出柱。中藥制劑的含量測定第94頁第三節(jié)慣用定量分析方法（2）正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法應用不如反相色譜法普及，主要用于分離分析溶于有機溶劑極性及中等極性分子型物質(zhì)。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相是正相色譜慣用極性鍵合相，流動相通慣用烷烴（慣用正已烷）加適量極性調(diào)整劑組成。

中藥制劑的含量測定第95頁第三節(jié)慣用定量分析方法（3）離子對色譜法

直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物方法作為離子對色譜法（PIC或IPC），該法可分為正相離子對色譜法和反相離子對色譜法，但近年來廣泛應用幾乎都是反相離子對色譜法，故本書只介紹反相離子對色譜法.①基本原理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑有機溶媒-水溶液為流動相，用以分離離子型或可離子化化合物.②適用范圍:適合用于有機酸、堿、鹽分離;用離子交換色譜法無法分離離子和非離子混合物分離;在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機酸分析。

③缺點:離子對試劑價格比較貴.④分離條件選擇:離子對試劑性質(zhì)和濃度、流動相pH值及流動相中所含有機溶劑種類與百分比等。中藥制劑的含量測定第96頁第三節(jié)慣用定量分析方法i離子對試劑選擇通常所選取離子對試劑電荷應與試樣離子電荷相反。離子對試劑主要應用對象1、季銨類（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基銨）強酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺類藥品、水溶性維生素）2、叔胺類（如三辛基胺）磺酸鹽等3、烷基磺酸鹽（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸鹽）強堿和弱堿（如兒茶酚胺、罌粟堿、煙酰胺）4、高氯酸各種堿性物質(zhì)（如有機胺、肽）5、烷基硫酸鹽（如辛烷、十二烷基硫酸鹽）應用對象同烷基磺酸鹽中藥制劑的含量測定第97頁第三節(jié)慣用定量分析方法反相離子對色譜法中流動相pH值選擇標準樣品類型流動相PH值說明1、強酸（pKa<2）如磺酸染料2-7.4在整個pH范圍內(nèi)，樣品可離解，實際pH值選擇取決于共存其它組分類型。2、弱酸（pKa>2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5樣品可離解，其k值取決于離子正確性質(zhì)樣品離解被抑制，其k值取決于未離解樣品性質(zhì)。3、強堿（pKa>8）如季銨類2-8同強酸4、弱堿（pKa<8）如兒茶酚胺6-7.42-5樣品離解被抑制，其k值取決于未離解樣品性質(zhì)樣品可離解，其k值取決于離子正確性質(zhì)。ii.流動相pH值控制

中藥制劑的含量測定第98頁第三節(jié)慣用定量分析方法iii.有機溶劑選擇反相離子對色譜法中，甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)是最慣用流動相，流動相中所含有機溶劑百分比越高，組分k值越小。普通而言，樣品組分疏水性及離子對試劑疏水性越強，所需有機溶劑百分比越高。中藥制劑的含量測定第99頁第三節(jié)慣用定量分析方法（4）離子抑制色譜法原理:因為離子對試劑價格較貴，對弱酸、弱堿分離，往往采取離子抑制色譜法。經(jīng)過向流動相加入少許弱酸（慣用醋酸）、弱堿（慣用氨水）或緩沖鹽（慣用磷酸鹽及醋酸鹽），調(diào)整流動相pH值，抑制樣品組分解離，增加組分在固定相中溶解度，改進峰形，到達分離有機弱酸、弱堿目標，這種技術稱為離子抑制色譜法（ISC）。特點:該方法簡便、經(jīng)濟實用、分離效果好，在許多場所可替換離子對色譜法，但重復性較差是其缺點。適用范圍:離子抑制色譜法通慣用于反相色譜中，適合用于3.0≤pKa≤7.0弱酸、7.0≤pKa≤8.0弱堿和兩性化合物分離，以及它們與分子型化合物共存時分離。中藥制劑的含量測定第100頁第三節(jié)慣用定量分析方法離子抑制色譜法與離子對色譜法區(qū)分：

①離子抑制色譜法是向流動相中加入抑制劑，調(diào)整pH值，抑制樣品組分解離，使其以分子形式存在。而離子對色譜法是加入離子對試劑，并調(diào)整pH值使樣品組分盡可能呈解離狀態(tài)，使離子對試劑反離子與樣品離子結(jié)合成中性離子對。②離子抑制色譜僅適合用于弱堿、弱堿分離，不適合用于有機強酸、強堿分離；而離子對色譜法對不一樣強度酸、堿均適用。中藥制劑的含量測定第101頁第三節(jié)慣用定量分析方法（四）定量分析方法HPLC慣用定量方法有:外標法、內(nèi)標法（內(nèi)標對比法和內(nèi)標標準曲線法）內(nèi)加法。中藥制劑的含量測定第102頁第三節(jié)慣用定量分析方法六、原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法是基于從光源輻射出含有待測元素特征譜線光，經(jīng)過試樣蒸氣時被待測元素基態(tài)原子所吸收，由輻射譜線被減弱程度（即原子吸光度）來測定試樣中該元素含量。該法能測定幾乎全部金屬元素和一些半金屬元素，已廣泛應用于中藥制劑及中藥材中重金屬、毒害元素及微量元素檢測。優(yōu)點:靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好、干擾較少、操作簡便快速、測定范圍廣等優(yōu)點；

缺點:是標準工作曲線線性范圍窄、測定不一樣元素普通需用不一樣光源燈且試驗條件要求嚴格。中藥制劑的含量測定第103頁第三節(jié)慣用定量分析方法(一)基本原理一個原子可含有各種能級狀態(tài)，在正常情況下原子是以其最低能態(tài)即基態(tài)形式存在，當吸收適當頻率輻射原子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，其中原子由基態(tài)躍遷到第一激發(fā)態(tài)時所產(chǎn)生吸收線稱為共振線。因為各種元素原子結(jié)構和外層電子排布不一樣，不一樣元素原子從基態(tài)激發(fā)到第一激發(fā)態(tài)時吸收能量不一樣，各種元素共振線各有其特征性，稱為元素特征譜線。對大多數(shù)元素來說，共振線是該元素全部譜線中最靈敏譜線，通常選擇待測元素共振線作為原子吸收定量分析線。中藥制劑的含量測定第104頁第三節(jié)慣用定量分析方法（三）樣品處理原子吸收光譜分析通常是溶液進樣，被測樣品需事先轉(zhuǎn)化為溶液樣品，預處理方法與通?；瘜W分析相同，要求試樣分解完全，在分解過程中應預防沾污和防止待測組分損失，所用試劑及反應產(chǎn)物對后續(xù)測定應無干擾。分解試樣最慣用方法是用酸溶解和堿熔融，近年來微波溶樣法取得了廣泛應用。通常采取稀酸、濃酸或混合酸處理，酸不溶物質(zhì)采取熔融法。無機試樣如礦物類藥品大都采取這類方法。有機試樣通常先進行消化處理，以除去有機物基體，消化后殘留物再用適當酸溶解。消化處理主要分干法消化和濕法消化兩種，被測元素若是易揮發(fā)元素（如Hg、As、Cd、Pb、Sb、Se等），則不能采取干法消化，因為這些元素在消化過程中損失嚴重。中藥制劑的含量測定第105頁第三節(jié)慣用定量分析