GB/T 41627-2022 動物源空腸彎曲菌檢測方法（正式版）

ICSCCSGB/T41627—2022動物源空腸彎曲菌檢測方法DetectionmethodofCampylobacterjejunifromanimalsamples國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T41627—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。1動物源空腸彎曲菌檢測方法本文件描述了動物源空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)多重PCR的檢測方法。本文件適用于畜禽養(yǎng)殖和屠宰過程中動物源空腸彎曲菌的檢測。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.9—2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗空腸彎曲菌檢驗NY/T1948獸醫(yī)實驗室生物安全要求通則本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。CFU:菌落形成單位(Colony-formingunit)DMSO:二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)mCCDA:彎曲菌選擇性瓊脂(Modifiedcharcoalcefoperazonedeoxycholateagar)MHA:MuellerHinton瓊脂(MuellerHintonagar)PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphatePCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction)5設(shè)備和材料5.1冰箱：冷藏溫度為2℃~8℃。5.2恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃、42℃±1℃。5.3高壓滅菌鍋：滅菌溫度為121℃,工作壓力為0.1MPa。5.4恒溫振蕩培養(yǎng)箱：180r/min、42℃±1℃。5.5微需氧培養(yǎng)裝置：5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣。5.6無菌棉簽。2GB/T41627—20225.11無菌剪刀。5.12無菌鑷子。5.13無菌平皿。5.24PCR管。6培養(yǎng)基與試劑6.1mCCDA:見附錄A中A.1。6.12介于100bp～2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。3GB/T41627—2022空腸彎曲菌檢驗程序見圖1。樣品采集家禽養(yǎng)殖場家畜養(yǎng)殖場屠宰場或糞便拭了飼料禽蛋養(yǎng)殖環(huán)境或糞便拭了飼料鮮奶養(yǎng)殖環(huán)境腸內(nèi)容物肉樣品堵宰場環(huán)境增菌微需氧微需氧24h~48h增菌微需氧微需氧增菌微需氧微需氧選擇性培養(yǎng)基分離37℃±1℃或彎曲菌的多重PCR鑒定空腸彎曲菌用無菌棉簽采集家禽泄殖腔內(nèi)或家畜直腸內(nèi)糞便約0.1g,放入Cary-Blair運輸培養(yǎng)基中保存。用無菌棉簽采集家禽或家畜的新鮮糞便約0.1g,放入Cary-Blair運輸培養(yǎng)基中保存。用無菌棉簽擦拭禽蛋表面，放入無菌采樣袋中封口保存。4GB/T41627—20229.1.4鮮奶樣品用無菌采樣袋或無菌采樣管采集鮮奶樣品約50mL,封口保存。用無菌鑷子夾取養(yǎng)殖場貯藏的飼料或墊料10g,分別放入無菌采樣袋中封口保存。用無菌鑷子夾取養(yǎng)殖環(huán)境中的飼料和墊料10g,分別放入無菌采樣袋中封口保存。取養(yǎng)殖場家禽或家畜的飲用水1L～4L和養(yǎng)殖環(huán)境中的污水20mL～50mL,放入無菌采樣瓶中保存。用無菌棉簽擦拭樣品的表面(面積至少100cm2),放入無菌采樣袋中封口保存。用無菌采樣袋采集大塊肉樣品約100g,封口保存。樣品運輸過程中，應(yīng)避光保存，保存溫度為0℃~20℃,樣品應(yīng)在24h內(nèi)進行處理。如果采樣與樣品處理的間隔時間較長，樣品應(yīng)在4℃±2℃中低溫保存，并在72h內(nèi)進行處理。9.3樣品處理及增菌即取懸濁液100μL,涂布于mCCDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h~48h。取25mL蛋黃液或蛋漿樣品加入125mLBolton肉湯中均質(zhì)混合(1:6稀釋),取25mL混合液加入100mLBolton肉湯中并混勻(1:30稀釋),同時將1:6和1:30稀釋的混合液分別置于恒溫振蕩5GB/T41627—2022培養(yǎng)箱中，42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h,進行增菌。將50mL鮮乳樣品在4℃下10000r/min離心30min后棄去上清液，用10mLBolton肉湯重懸沉淀(盡量避免帶入油層),將懸濁液轉(zhuǎn)移至90mLBolton肉湯中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h～480.1%蛋白胨水轉(zhuǎn)移至250mL離心管中，在4℃下5000r/min離心15min后棄去上清液，用10mL0.1%蛋白胨水重懸沉淀，吸取3mL懸濁液，加入100mLBolton肉湯中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h,進行增菌。10mL均質(zhì)液加入90mLBolton肉湯中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)用PBS將24h增菌液和48h增菌液分別進行1:50的稀釋，將100μL增菌液及對應(yīng)的1:50稀釋液分別劃線接種于彎曲菌選擇性mCCDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h。觀察24h培養(yǎng)與48h培養(yǎng)的瓊脂平板上的菌落形態(tài)，彎曲菌在mCCDA平板上的疑似菌落通常板上，在37℃±1℃或42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h。將空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11351接種于MHA血平板上，在37℃±1℃或42℃±1℃微需氧條件下培養(yǎng)24h～48h,作為陽性對照。關(guān)于彎曲菌屬的生化鑒定，按GB4789.9—2014中5.4.1的實驗方法進行操作。6GB/T41627—2022關(guān)于空腸彎曲菌的生化鑒定，按GB4789.9—2014中5.4.2的實驗方法進行操作。9.6彎曲菌的多重PCR鑒定9.6.1多重PCR模板的制備彎曲菌疑似單菌落4～5個，放置于干式恒溫金屬浴中100℃處理10min,冷卻后，以12000r/min離心2min,上清液作為多重PCR反應(yīng)的細(xì)菌DNA模板。同時，制備空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11351的9.6.2多重PCR反應(yīng)程序參考A.5制備25μL多重PCR反應(yīng)體系。在基因擴增儀設(shè)置多重PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min;95℃變性30s,59℃退火90s,72℃延伸1min,35個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后置于4℃保存。取9μL多重PCR產(chǎn)物和1μL的10×DNA凝膠加樣緩沖液均勻混合，并與5pL介于100bp~2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分別加入1.2%的瓊脂糖凝膠點樣孔中，進行電泳。電泳緩沖液為0.5×TBE,電壓110V,電泳時間20min～30min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀進行成像分析，通過介于100bp～2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的已知條帶長度判斷菌落的PCR條帶長度。9.6.4.1多重PCR反應(yīng)程序有效性判定空腸彎曲菌陽性對照同時出現(xiàn)857bp彎曲菌屬特異性擴增條帶及539bp空腸彎曲菌的特異性擴照同時正確時，判定多重PCR反應(yīng)程序有效。凝膠成像儀中陽性對照和陰性對照擴增結(jié)果見A.9.3。同時出現(xiàn)857bp和539bp擴增條帶的樣品判定為空腸彎曲菌核酸陽性。未同時出現(xiàn)857bp和539bp擴增條帶的樣品判定為空腸彎曲菌核酸陰性。7培養(yǎng)基與試劑A.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.1.1.1成分營養(yǎng)肉湯25.0g活性炭4.0g水解酪蛋白3.0g硫酸亞鐵0.25g丙酮酸鈉0.25g瓊脂12.0gA.1.2抗生素溶液配方抗生素質(zhì)量質(zhì)量濃度兩性霉素B20mLDMSO利福平0.25g10mLDMSO25.0mg/mL甲氧芐氨嘧啶0.25g50mL乙醇5.0mg/mL放線菌酮2.5g50mL乙醇50.0mg/mL頭孢哌酮3.2g50mL超純水多黏菌素B0.1675g50mL超純水3.4mg/mLA.1.3完全培養(yǎng)基A.1.3.1成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基抗生素溶液：8GB/T41627—2022兩性霉素B400μL利福平200μL放線菌酮lmL頭孢哌酮lmL多黏菌素BlmL當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基溫度約為55℃時，在無菌條件下加入抗生素溶液，混勻，校正pH至7.4±0.2。將15mL完全培養(yǎng)基傾倒于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。制備的平板在室溫放置不應(yīng)超過4h,或在4℃冷藏不應(yīng)超過7d。使用前應(yīng)干燥平板。A.2MHA血平板A.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.2.1.1成分牛肉膏粉2.0gA.2.2無菌脫脂纖維綿羊血璃珠。A.2.3完全培養(yǎng)基A.2.3.1成分無菌綿羊血50mL當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度約為55℃時，在無菌條件下加入綿羊血，混勻，校正pH至7.4±0.2。將15mL完全培養(yǎng)基傾倒于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。制備的平板為干燥時在室溫放置不宜超過94h,或在4℃冷藏不宜超過7d。使用前應(yīng)干燥平板。A.3Bolton肉湯A.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.3.1.1成分碳酸鈉0.6gA.3.1.2制法將A.3.1.1中各成分溶于蒸餾水中，121℃,滅菌15min,備用。溶劑溶劑50mL乙醇g50mL超純水質(zhì)量兩性霉素B萬古霉素A.3.3完全培養(yǎng)基A.3.3.1成分兩性霉素B甲氧芐氨嘧啶萬古霉素3.4mg/mLGB/T41627—2022頭孢哌酮多黏菌素BlmLA.3.3.2制法溫放置不宜超過4h,或在4℃冷藏不宜超過7d。瓊脂5.0g硫乙醇酸鈉1.5g磷酸氫二鈉1.1g氯化鈉5.0g氯化鈣9.0mg蒸餾水1000mLA.4.2Cary-Blair培養(yǎng)基制法除氯化鈣外，將其他成分均按上述成分配制，加熱溶解。冷卻至55℃,校正pH到8.4±0.2,加入不宜超過4h,或在4℃冷藏不宜超過7d。A.5.1彎曲菌的多重PCR引物序列及擴增片段長度彎曲菌多重PCR反應(yīng)體系的引物序列及擴增片段長度見表A.1。表A.1鑒定彎曲菌的PCR引物序列及擴增片段長度基因引物序列擴增片段長度16S1:5'-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3′16S?:5'-GGACGGTAACTAGTTTAmapAmapA?:5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3′mapA?:5'-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3ceuE?:5'-AATTGAAAAATTGCTCCAACTATG-3ceuE?:5'-TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG-3A.5.2多重PCR反應(yīng)體系10×擴增緩沖液mapA?(2.5nmol/L)lμLMg2+(25mmol/L)2μLTaqDNA聚合酶2.5U模板DNA2μL加ddH?O至25μLA.6.1成分氯化鈉8.8g氯化鉀0.2g十二水合磷酸氫二鈉2.9g磷酸二氫鉀0.2gA.6.2制法將A.6.1中成分溶于800mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4,最后定容到1L,121℃滅菌15min。A.7.1成分蛋白胨1.0g