抗菌抗病毒常用實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用方法知識

抗菌抗病毒慣用實(shí)驗(yàn)研究辦法細(xì)菌、病毒性疾病是當(dāng)前國內(nèi)外流行重要傳染病,特別是近兩年來,由冠狀病毒引起SARS及由流感病毒引起禽流感給動(dòng)物及人類帶來嚴(yán)重危害,是人所共知"由于各種疫苗不斷浮現(xiàn),雖然某些細(xì)菌、病毒病已得到了有效控制,但是其治療尚無有效解決辦法因而研制高效、低毒新型中藥抗菌、抗病毒制劑已成為巫待解決問題。1、慣用抗菌辦法1、1稀釋法1、1、1試管稀釋法培養(yǎng)基內(nèi)抗生素含量按幾何級數(shù)稀釋并接種適量細(xì)菌，經(jīng)孵育后，觀測能引起抑菌作用最低抗生素濃度，稱最低抑菌濃度(MIC)為該菌對藥物敏感度。稀釋法所獲得成果比較精確，常被用作校正其她辦法原則。如如下黃貝貝等青錢柳抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究和黃利權(quán)等火絨草抗菌活性研究實(shí)驗(yàn)辦法:1、應(yīng)用試管稀釋法,測定青錢柳提取物對實(shí)驗(yàn)菌抑菌效果,檢查不同濃度下青錢柳提取物對細(xì)菌、霉菌抗菌作用。成果:青錢柳提取物在體外對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌等革蘭氏陽性菌具備較強(qiáng)抗菌作用;而對大腸埃希氏菌、銅綠假單孢菌等革蘭氏陰性菌抗菌作用不明顯;對黃曲霉、煙曲霉等霉菌抗菌作用不明顯[1]。2、采用試管稀釋法,分別測定了火絨草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚某些、醇提乙酸乙酯某些、醇提正丁醇某些、醇提水溶某些等7種提取物對大腸桿菌C83882、大腸桿菌C83903、大腸桿菌C83914、沙門氏菌C79-20、金黃色葡萄球菌NewbouldS-305、金黃色葡萄球菌臨床分離株等6株病原菌最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。實(shí)驗(yàn)成果表白,火絨草醇提物及其石油醚某些和乙酸乙酯某些對兩種金黃色葡萄球菌具備較強(qiáng)抑制作用,其MIC為0114mg/ml生藥濃度,MBC為0127mg/ml生藥濃度,而其他某些對金黃色葡萄球菌抑制作用較弱?；鸾q草醇提正丁醇某些和水溶某些對3株大腸桿菌和1株沙門氏菌具備較強(qiáng)抑制作用,其MIC為2170mg/ml生藥濃度,MBC為2170mg/ml生藥濃度,顯示了較強(qiáng)抗菌活性[2]。1、1、2肉湯稀釋法以水解酪蛋白(M-H)液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度稀釋，然后種入待檢細(xì)菌，定量測定抗菌藥物抑制或殺死該菌最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度(MBC)。如劉菁菁研究藍(lán)玉簪龍膽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)體內(nèi)外抗菌活性。藍(lán)玉簪龍膽分別以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸餾水提取，得到極性不同4某些產(chǎn)物，運(yùn)用肉湯稀釋法測定其對MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)最低抑菌濃度(MIC)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)承翰捎酶骨蛔⑸銶RSA法建立小鼠感染模型，分別予以藍(lán)玉簪龍膽水提液高、中、低劑量，銀黃膠囊治療15d，并與模型對照組比較，觀測存活率。成果：體外實(shí)驗(yàn)：藍(lán)玉簪龍膽各極性組分對MRSA和MSSA菌株均有不同限度抑菌作用，其中正丁醇組分抑菌作用最強(qiáng)，另一方面為乙醇、水層組分；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：除了藍(lán)玉簪龍膽大劑量組，別的各治療組存活率均高于模型對照組，而藍(lán)玉簪龍膽中劑量組存活率最高。結(jié)論藍(lán)玉簪龍膽對MRSA和MSSA均具備一定抗菌作用，并且敏感性差別無明顯性；對MRSA感染小鼠有一定治療作用[3]。胡景玉等為了理解衡水地區(qū)大腸埃希菌藥敏狀況，采用肉湯稀釋法18種抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）并計(jì)算其MIC50和MIC90。成果亞胺培南、哌拉西林、她唑巴坦和頭孢哌酮、舒巴坦顯示良好抗菌作用，其MIC50分別為0.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml；MIC90均為2μg/ml，其她藥物顯示不同限度耐藥，且大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs檢出率較高。結(jié)論檢出大腸埃希菌存在多重耐藥，僅對亞胺培南、哌拉西林、她唑巴坦和頭孢哌酮、舒巴坦普遍敏感[4]。KianbakhtS等通過肉湯稀釋法研究刺蒺藜不同部位（果、莖葉、根）甲醇提取物對金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、腸埃希氏菌ATCC25922、綠膿桿菌ATCC27853四種細(xì)菌抗菌能力，研究成果表白：果、莖葉對四種菌MIC值均為2mg/ml；根甲醇提取物對MIC值對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、腸埃希氏菌均為4mg/ml，對綠膿桿菌MIC值為2mg/ml[5]。1、1、3瓊脂平板稀釋法將不同濃度抗菌藥物，分別加入到定量瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，制成固體含藥平皿，使每一種平皿中所含抗菌藥物濃度相差2倍，用多點(diǎn)接種儀把待測細(xì)菌點(diǎn)種到具有抗菌藥物瓊脂培養(yǎng)基表面上，在特定溫度下培養(yǎng)恰當(dāng)時(shí)間后，平皿上無菌落生長最低藥物濃度為抗菌藥物對受試菌種最低抑菌濃度。每一次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)用原則菌株做質(zhì)控。瓊脂平板稀釋法本法特點(diǎn)是可同步進(jìn)行大量菌株藥敏測定。也合用于中草藥和厭氧菌藥敏測定。如汪黎虹等應(yīng)用超微粉碎法將虎杖、石榴皮、馬齒莧、苦楝皮、大黃等10種中藥進(jìn)行加工解決至粒徑為5~10μm后，運(yùn)用瓊脂稀釋法測定其實(shí)驗(yàn)室近年來收集患病鰻鱺中分離得到18株常用致病菌抑菌作用。成果表白：上述10種中藥單用對除B12肺炎克雷伯菌以外17株養(yǎng)殖鰻鱺重要致病菌均有一定抑制作用，其平均抑菌濃度(MIC)范疇為0.165~128mg/mL，平均殺菌濃度(MBC)范疇為0.210~128mg/mL[6]。1、1、4濃度梯度法濃度梯度實(shí)驗(yàn)是一種定量抗生素藥敏測定技術(shù)，可用于非苛養(yǎng)革蘭陽性和陰性需氧菌(如腸桿菌、假單胞菌、葡萄球菌和腸球菌)以及苛養(yǎng)菌(如厭氧菌、肺炎鏈球菌和嗜血桿菌)藥敏測定。該系統(tǒng)包具有一種預(yù)先制備好抗生素濃度梯度，可用于在瓊脂培養(yǎng)基判斷某抗生素對微生物最小抑菌濃度(MIC)。如劉芳等武漢地區(qū)住院患兒感染肺炎鏈球菌耐藥狀況。如劉芳等收集醫(yī)院1-12月住院患兒分離肺炎鏈球菌1521株，采用紙片擴(kuò)散法及E-test法進(jìn)行抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn);按CLSI年版判斷成果；使用X2檢查分析耐藥性變化。研究結(jié)論為武漢地區(qū)住院患兒分離肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素及磺胺甲噁唑、甲氧芐啶敏感率極低，對左氧氟沙星及萬古霉素均有極高敏感率，對青霉素仍保持較高敏感率，可作為治療普通肺炎鏈球菌感染首選藥物[7]。1、1、5試管兩倍稀釋法試管兩倍稀釋法取生長濁度達(dá)9×108mg/ml菌液，菌液用培養(yǎng)液稀釋，接種于無菌試管中，然后加入不同濃度抗菌藥物或未知藥物，37℃孵育。16～24h，以無細(xì)菌生長最低濃度為MIC。將無細(xì)菌生長完全清晰液再移種于不含抗菌藥物血平板中，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，菌落數(shù)不超5個(gè)平板最低藥物濃度即為該藥物MBC。普通以MIC來評價(jià)細(xì)菌對藥物敏感度。馬加慶等采用試管兩倍稀釋法觀測利膽止痛膠囊在體外對甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌及痢疾桿菌、大腸桿菌和沙門菌生長影響．研究成果表白：利膽止痛膠囊對金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、痢疾桿菌和大腸桿菌MIC分別為25、50、50、25和12.5mg/mL，對沙門菌無明顯抑菌作用[8]。1、1、6微量肉湯稀釋法微量肉湯稀釋法原理：原理同肉湯稀釋法。石功名等對西她沙星與莫西沙星抑制細(xì)胞內(nèi)外金黃色葡萄球菌ATCC25923活性進(jìn)行體內(nèi)外研究，采用微量肉湯稀釋法檢測藥物MIC，MBC及MPC，研究成果表白：在體外實(shí)驗(yàn)中，MIC，MBC，MPC及時(shí)間與濃度殺菌曲線實(shí)驗(yàn)表白西她沙星胞內(nèi)外抑菌活性均強(qiáng)于莫西沙星[9]。1、1、7微量稀釋法微量稀釋法本法為改進(jìn)試管稀釋法。取稀釋菌液接種在96孔板中，然后加入待試抗菌藥物，混勻后放置37℃孵育16～24h，在襯有黑底板光線下觀測，細(xì)菌生長時(shí)小孔呈彌散狀混濁或在孔底部有圓形或絲狀沉淀；無細(xì)菌生長時(shí)孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為MIC。把無細(xì)菌生長孔內(nèi)液體移種不含抗菌藥物血平板中，菌落數(shù)少5個(gè)平板最低藥物濃度即為MBC。如宋曉晶等通過微量稀釋法分別測定特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素對38株臨床分離口腔念珠菌體外敏感性。研究成果表白：38株白念珠菌對氟康唑耐藥4株，敏感34株；對伊曲康唑耐藥5株，敏感33株；對特比奈芬耐藥15株，敏感23株；制霉菌素均敏感[10]。1、2紙片瓊脂擴(kuò)散法瓊脂擴(kuò)散法是將抗菌藥物加至接種實(shí)驗(yàn)菌平板表面，抗菌藥物在瓊脂膠內(nèi)向四周自由擴(kuò)散，其濃度隨擴(kuò)散距離增大而減少，在藥物一定擴(kuò)散距離內(nèi)，由于藥物抗菌效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)菌不能生長，此無菌生長范疇稱為抑菌圈，抑菌圈大小與藥物抑菌效應(yīng)成正比。如熊楓等從西太平洋近赤道區(qū)采集到18個(gè)深海沉積物樣品中分離到83株海洋真菌,采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法和MTT法分別對其發(fā)酵液乙酸乙酯抽提物抗菌、抗腫瘤活性進(jìn)行篩選.成果顯示,有37株菌株對至少一種批示菌有抑制作用;有29株菌株對KB或Raji腫瘤細(xì)胞具備明顯抑制活性,分別占總供測菌株44.6%和34.9%.在抗腫瘤活性菌株中,WP-M-1、DY-G-2、DY-C-2、WP-K-3和WP-Q-2等5株菌具備很高活性,其發(fā)酵液乙酸乙酯抽提物對Raji細(xì)胞IC50分別為5.000、1.064、2.796、1.920、0.520Lg/mL.研究成果表白,海洋沉積物來源真菌中蘊(yùn)藏著豐富抗菌及抗腫瘤活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌,是開發(fā)抗菌和抗腫瘤藥物寶貴資源[11]。又如鄔曉勇等建立了蛙皮抗菌肽活性測定辦法———TTC微量稀釋法；運(yùn)用SephadexG25凝膠層析分離抗菌肽粗品獲得一種活性組分命名為G5，運(yùn)用TTC微量稀釋法測定活性組分G5抑制大腸桿菌MIC是80μg/mL、抑制銅綠假單胞菌MIC是20μg/mL、抑制金黃色葡萄球菌MIC是80μg/mL；活性組分G5再經(jīng)凝膠HPLC分離純化獲得兩個(gè)活性組分Ⅰ和Ⅱ，組分Ⅰ和組分Ⅱ再分別通過RP-HPLC分離純化獲得兩個(gè)色譜純活性組分命名為RanaⅠ和RanaⅡ[12]。1、3平板稀釋法如吳決等探討抗菌性中藥藥物敏感實(shí)驗(yàn)在鑒定中藥新藥上應(yīng)用。應(yīng)用中藥藥敏實(shí)驗(yàn)平板稀釋法鑒定中藥新藥/萬力通0對常用十余種細(xì)菌最低抑菌濃度(MIC).成果運(yùn)用平板稀釋法測定中藥新藥MIC,效果抱負(fù).結(jié)論在中藥藥敏實(shí)驗(yàn)諸辦法中,平板稀釋法鑒定中藥新藥抑菌作用,辦法簡便,易操作,成果易觀測[13]。1、4打洞法如向紅采用平板打洞法對西南委陵菜(Potentillafuigens)全草、根、葉水煎劑進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)。成果表白,全草、根、葉水煎劑對G-大腸桿菌、G-志賀氏痢疾桿菌、G+金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。不同入藥部位對同一細(xì)菌抑菌能力不同,作用強(qiáng)弱與藥液濃度大小關(guān)于;同一入藥部位對不同細(xì)菌無明顯選取抑制作用[14]。再如袁婷等常用中草藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用體外抑菌實(shí)驗(yàn)平板打洞法、試管兩倍稀釋法和平板培養(yǎng)法對本地常用中草藥一枝黃花、黑老虎、土甘草、花木通等進(jìn)行了對肺炎鏈球菌、蠟狀芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌藥物敏感性測定。成果一枝黃花對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌呈高度敏感，最小抑菌濃度分別為1/80和1/40，最小殺菌濃度分別為1/20和1/10；對肺炎鏈球菌、蠟狀芽孢桿菌呈中度敏感，最小抑菌濃度均為1/20，未見最小殺菌濃度,黑老虎、土甘草均對肺炎鏈球菌呈高度敏感，最小抑菌濃度均為1/80，最小殺菌濃度分別為1/20和1/10，對鼠傷寒沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用；花木通則對四種供試菌均未見抑菌作用[15]。1、5挖溝法如武延雋等理解巴豆油抗菌譜。辦法:采用瓊脂挖溝法與瓊脂絕對濃度法[3,6],對20種臨床常用病原菌和條件致病菌進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室條件下,巴豆油抗菌活性研究。成果:瓊脂絕對濃度法,巴豆油在1B10~1B40濃度時(shí),對金黃色葡萄球菌有抑制生長作用,對別的19種細(xì)菌均無作用;瓊脂挖溝擴(kuò)散法,巴豆油對所有20種實(shí)驗(yàn)菌均無抑制生長作用。結(jié)論:瓊脂挖溝擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)中,巴豆油對所有實(shí)驗(yàn)菌均無抗菌活性,而在瓊脂絕對濃度法實(shí)驗(yàn)中1B40稀釋濃度對金黃色葡萄球菌仍有抗菌活性,不同辦法影響巴豆油抗菌成果[16]。2、抗病毒辦法2、1細(xì)胞病變法(cytopathiceffect，CPE)細(xì)菌病變法是以CPE為指標(biāo),辦法簡便,可以對多數(shù)藥物抑制病毒增殖效果進(jìn)行測定與評價(jià)。普通以加號表達(dá)細(xì)胞病變限度,細(xì)胞病變<25%為+,細(xì)胞病變25%~50%為++,細(xì)胞病變50%~75%為+++,細(xì)胞病變>75%為++++。如張春江等探討藏藥甘青烏頭抗單純皰疹病毒II型（HSV-2）作用和機(jī)制。辦法MTT法測定甘青烏頭對Vero細(xì)胞毒性，采用細(xì)胞病變法和蝕斑法測定甘青烏頭體外抗病毒活性，以半數(shù)抑制濃度和治療指數(shù)為評價(jià)指標(biāo)；定量熒光PCR法和蝕斑法考察甘青烏頭體外抗病毒作用機(jī)制。用HSV-2建立小鼠腦炎模型，對甘青烏頭體內(nèi)抗單純皰疹病毒抗病毒活性進(jìn)行評價(jià)。成果：甘青烏頭對Vero細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(CC50)為5.57g·L-1。細(xì)胞病變法和蝕斑法測得甘青烏頭半數(shù)有效濃度(EC50)分別為2.25，1.68g·L-1，治療指數(shù)TI分別為2.47，3.32。LD50值為0.85g·kg-1。甘青烏頭延長了小鼠平均存活時(shí)間，對小鼠死亡顯示出10%保護(hù)率。甘青烏頭能直接滅活HSV-2，可以明顯抑制HSV-2感染性；對病毒吸附到細(xì)胞沒有抑制作用，能抑制HSV-2大分子增值。抑制HSV-2DNA合成抑制倍數(shù)達(dá)102。結(jié)論：甘青烏頭體外具備較強(qiáng)抗HSV-2活性，抗病毒作用是通過抑制病毒復(fù)制循環(huán)各個(gè)環(huán)節(jié)起作用[17]。2、2染料吸取法2、2、1MTT染色法MTT可被活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原成紫色不溶性結(jié)晶(顆粒)并沉積在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周邊,而死細(xì)胞則無此功能。二甲基亞砜(DMSO)或酸化異丙醇能溶解細(xì)胞中紫色不溶性結(jié)晶物,用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光密度值(OD),可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范疇內(nèi),MTT結(jié)晶物形成量與細(xì)胞數(shù)成正比,因而可用于抗病毒藥物活性篩選。如付光發(fā)等中藥鴨拓草提取物抗病毒作用研究。在96孔培養(yǎng)板單層培養(yǎng)vero細(xì)胞,將鴨拓草提取物按照倍比關(guān)系稀釋,濃度分別為25.6mg/ml12.8mg/ml6.4mg/ml3.2mg/ml1.6mg/ml0.8mg/ml0.4mg/ml0.2mg/ml0.lmg/ml,每一稀釋濃度都要重復(fù)3次,同步設(shè)正常細(xì)胞對照,觀測細(xì)胞病變,采用MTT法,在培養(yǎng)過48h細(xì)胞中,加入含MTT培養(yǎng)液5mg/ml,每孔0.01ml,繼續(xù)培養(yǎng)4一6h后,加入二甲亞礬,每孔0.lml,測定其在570nm波長下吸光度。將Vero細(xì)胞生長呈單層孔培養(yǎng)板上,加入100而TCro50HZN3型病毒液,每孔加入0.lml,lh后,除去病毒液,加入TCS(12.80mg/ml)1/10倍稀釋出5個(gè)濃度鴨拓草提取物,再以4倍倍比稀釋,即分別為1280、320、80、20、5vg/ml,并設(shè)病毒對照,細(xì)胞對照,受試藥物和陽性藥物對照組用此法檢測病毒抑制率,按照Probit回歸法計(jì)算IC50[18]。又如KrusePF，Patterson等采用MTT法評價(jià)清熱消炎復(fù)方制劑體外抗柯薩奇病毒(CVB3)、呼吸道合胞病毒(RSV)效果。辦法:待正常細(xì)胞長成單層,用病毒感染,培養(yǎng)一定期間后,依照不同病毒感染細(xì)胞浮現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)間不同,加入一定量MTT液,然后測定OD570值,計(jì)算病毒抑制率。成果:MTT法較光鏡CPE法更為客觀,能以O(shè)D值變化反映藥物對病毒抑制限度,從而獲得實(shí)驗(yàn)成果,且便于記錄學(xué)解決。成果證明MTT法是一種能廣泛應(yīng)用于抗病毒藥物篩選和評價(jià)辦法[19]。2、2、2中性紅染色法中性紅染料吸取法原理是活細(xì)胞可以吸取一種弱陽離子染料)))中性紅,后者與活細(xì)胞胞漿中陰離子結(jié)合而滯留于活細(xì)胞中,并不被細(xì)胞洗滌液洗脫,滲入活細(xì)胞中性紅量與活細(xì)胞數(shù)量成正比,因而OD值直接反映活細(xì)胞數(shù)量,與細(xì)胞增殖限度成正比。普通依照各組之平均OD值,計(jì)算抑制百分率,再按ReedandMuench法計(jì)算IC50。抑制百分率=實(shí)驗(yàn)組平均OD值-病毒對照組平均OD值\細(xì)胞對照組平均OD值-病毒對照組平均OD值勤x100%如高川等探討白穎苔草粗提物對呼吸道合并胞體病毒(RSV)、甲型流感病毒(FluA)和柯薩基病毒B3(CoxB3)體外抑制作用。辦法:采用超聲提取,獲得藥物粗提物,以HEK293-RSV、MDCK-FluA和HEK293-CoxB3體外感染模型,通過顯微鏡下觀測細(xì)胞病變,酶標(biāo)儀測定中性紅染色A540值,計(jì)算抑毒指數(shù)評價(jià)抗病毒效果。成果:白穎苔草丙酮-乙酸乙酯粗提物可抑制RSV和FluA細(xì)胞病變效應(yīng),抑毒指數(shù)分別為14.22和92.41,對CoxB3病毒抑毒指數(shù)為1。結(jié)論:白穎苔草對RSV和FluA具備明顯抑制作用,而對CoxB3無抑制作用[20]。再如褚秀玲等采用中性紅染色法檢測人參皂苷及其衍生物抗馬立克病毒作用研究，研究成果表白先加中藥后感染病毒時(shí)，人參皂苷和衍生物7體現(xiàn)出較強(qiáng)抑制病毒活性作用；先接病毒后加中藥時(shí)，人參皂苷和衍生物7體現(xiàn)出較強(qiáng)抑制病毒活性作用；病毒和藥物混合感作后加入細(xì)胞時(shí)，衍生物7，8,2體現(xiàn)出較強(qiáng)抑制病毒活性作用；綜合3種加藥實(shí)驗(yàn)成果,中藥抑制病毒活性作用由強(qiáng)到弱順序依次為衍生物7、人參皂苷、衍生物2、衍生物1、衍生物6和衍生物8[21]。2、3蝕斑減少法實(shí)驗(yàn)證明,將病毒接種于單層培養(yǎng)細(xì)胞,數(shù)天后固定細(xì)胞并染色,因病毒感染而導(dǎo)致變性細(xì)胞不被染色,形成蝕斑(空斑)。蝕斑減少法以此為基本,運(yùn)用蝕斑形成,以接種病毒后,在未添加實(shí)驗(yàn)藥物培養(yǎng)基上形成蝕斑數(shù)為100%對照,通過計(jì)算添加實(shí)驗(yàn)藥物培養(yǎng)基上形成蝕斑減少率,來研究實(shí)驗(yàn)藥物抗病毒活性。通慣用于對照蝕斑數(shù)為50-100個(gè)。超過該范疇,藥物感受性即減少,且會影響實(shí)驗(yàn)成果。此外蝕斑縮小也是抗病毒活性指標(biāo)。因而,蝕斑減少法是一種定量測定法,理論上一種蝕斑代表一種有感染性毒粒。藥物解決后,蝕斑數(shù)減少,表達(dá)病毒復(fù)制受到抑制,子代毒粒產(chǎn)生減少。蝕斑減少法定量精確,成果可靠。用一系列藥物濃度,可得到劑量反映曲線,合用于不同藥物抑制強(qiáng)度比較。由于操作較復(fù)雜。需較多細(xì)胞及藥物,不適合初篩,可作為二篩或有效藥物效價(jià)評估。2、4病毒抗原測定有些病毒不產(chǎn)生細(xì)胞病變或蝕斑,或者產(chǎn)生細(xì)胞病變過程較慢,如乙型肝炎病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒等。病毒復(fù)制過程可產(chǎn)生各種病毒基因編碼蛋白質(zhì),如表面糖蛋白、衣殼蛋白、酶蛋白及調(diào)控蛋白等,這些蛋白為病毒構(gòu)造蛋白或功能蛋白,浮現(xiàn)于病毒繁殖周期不同階段,均可作為病毒復(fù)制限度之指征。運(yùn)用抗原、抗體特異結(jié)合免疫學(xué)原理,用特異抗體檢測某一特異抗原,特別單克隆抗體應(yīng)用,更明顯地提高了免疫檢測法特異性。此外,可運(yùn)用定量PCR、熒光定量PCR等辦法測定病毒核酸。參照文獻(xiàn)[1]黃貝貝,葉荷平,HUANGXY,等.青錢柳抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),,18(4):48-49.[2]黃利權(quán),伍義行.火絨草抗菌活性研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,,105(1)：5-6.[3]劉菁菁.藍(lán)玉簪龍膽提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中華人民共和國藥理學(xué)通報(bào),,27(7):1024-1026.[4]胡景玉,杜紅麗,喬艷梅,等.245例大腸埃希菌臨床分離株藥敏分析[J].當(dāng)代防止醫(yī)學(xué),,39(21):5664-5666.[5]KianbakhtS,JahanianiF.EvaluationofAntibacterialActivityofTribulusterrestrisL.GrowinginIran[J].IranianJournalofPharmacologyandTherapeutics,,2(1):22-24.[6]汪黎虹,關(guān)瑞章,李忠琴,等.10種單味中藥對養(yǎng)殖鰻鱺重要致病菌抑制作用[J].集美大學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