5-氮-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡探究

1/15-氮-2′-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡探究15-氮-2-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡探究5-氮-2-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡探究【摘要】［目的］探討5-氮-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡機(jī)制。

［方法］以不同濃度的5-Aza-CdR作用于膀胱癌EJ細(xì)胞，以四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞的增殖程度，原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(TUNEL)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。

［結(jié)果］EJ細(xì)胞加入不同濃度的5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml），與對(duì)照組相比各組EJ細(xì)胞增長速度減慢。

與對(duì)照組相比，不同濃度的各組5-Aza-CdR（0.625，1.25，2.50，5.00mg/ml）可以顯著降低EJ細(xì)胞的增殖比和增高EJ細(xì)胞的凋亡指數(shù)(Plt;0.05)，且與5-Aza-CdR呈濃度依賴關(guān)系(Plt;0.05)；不同濃度的5-Aza-CdR作用EJ細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞明顯增加(Plt;0.05)。

［結(jié)論］5-氮-2-脫氧胞苷誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡并使EJ細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制膀胱癌EJ細(xì)胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】5-氮-2-脫氧胞苷膀胱腫瘤凋亡StudyonEJCellsApoptosisInducedby5-Aza-2-decxycytidine（5-Aza-CdR）25-氮-2-脫氧胞苷（5-Aza-2-decxycytidine，5-Aza-CdR）是一種特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過去甲基化作用可使多種CpG島高甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，恢復(fù)抑癌功能。

但5-氮-2-脫氧胞苷是否可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到治療腫瘤尚少見報(bào)道。

本研究以膀胱癌EJ細(xì)胞株為研究對(duì)象，以不同濃度的5-Aza-CdR作用于EJ細(xì)胞，觀察5-Aza-CdR對(duì)EJ細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，為膀胱癌的治療提供新的線索。

1材料與方法1.1材料膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞購自北京大學(xué)泌尿外科研究所。

5-Aza-CdR購自Sigma公司；PRMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清購自GIBCO公司；原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)（TdT-mediateddUTPnick-endlabeling，TUNEL）試劑盒購自武漢博士德公司。

其它試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：

將復(fù)蘇的EJ細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中，37C，100%濕度，5%CO2，95%空氣，每24h換液1次。

四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖程度:將培養(yǎng)的EJ細(xì)胞按隨機(jī)原則分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。

當(dāng)細(xì)胞達(dá)到亞融合狀態(tài)時(shí)，常規(guī)制成單細(xì)胞懸液，以5000個(gè)/孔將細(xì)胞接種于396孔板，每組4個(gè)平行孔。

培養(yǎng)24h后，4℃冰箱2h，使細(xì)胞同步化。

棄去培養(yǎng)液每孔按分組要求分別加入不同量的5-Aza-CdR(1mg/ml)及無血清培養(yǎng)液，使各孔的終體積均為200l，各組5-Aza-CdR的終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml,每一濃度重復(fù)4孔。

37℃,5%CO2，培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)液，各孔加入MTT20l(5mg/ml)，37℃孵箱4h；各孔加入二甲基亞砜150l，避光振蕩10min，酶標(biāo)儀640nm波長測(cè)定各孔吸光值，以增殖比（proliferationratio）表示增殖程度（增殖比=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值100%）。

原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：

采用六孔板蓋玻片培養(yǎng)法，調(diào)整細(xì)胞密度至5104/孔，培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔按分組要求分別加入不同量的5-Aza-CdR和無血清培養(yǎng)液，使各孔的終體積均為2ml，每組4個(gè)平行孔，各組5-Aza-CdR的終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。

37℃，5%CO2，培養(yǎng)48h后，以4%多聚甲醛固定，按原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒中說明書進(jìn)行操作，細(xì)胞核呈棕黃色染色判定為凋亡細(xì)胞。

光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。

凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100%。

流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化：

用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，按照隨機(jī)分組原則，將培養(yǎng)的細(xì)4胞分為5組：

空白對(duì)照組加入2ml無血清培養(yǎng)液，另4組加入2ml5-Aza-CdR(1mg/ml)，每組4個(gè)平行孔，各組5-Aza-CdR的終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5及5mg/ml。

細(xì)胞經(jīng)24h培養(yǎng)后，胰酶消化，70%冷乙醇固定，碘化丙啶(PI)避光染色，用FACSort型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。

1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析組間差異（t檢驗(yàn)）。

2結(jié)果2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖程度5-Aza-CdR對(duì)EJ細(xì)胞的增殖有抑制作用，加入5-Aza-CdR后，與空白對(duì)照組相比，不同濃度5-Aza-CdR組EJ細(xì)胞增殖比差異有顯著性(Plt;0.05)，且與5-Aza-CdR呈濃度依賴關(guān)系(Plt;0.05)。

見表1。

2.2原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡EJ細(xì)胞培養(yǎng)48h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于鏡下可見較多胞核染成棕黃色的凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組EJ細(xì)胞的凋亡指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異有顯著性(Plt;0.05)，且與5-Aza-CdR呈濃度依賴關(guān)系(Plt;0.05)。

見表1。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化EJ細(xì)胞培養(yǎng)24h后，用不同濃度的5-Aza-CdR作用EJ細(xì)5胞后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的分析顯示G0/G1期細(xì)胞明顯增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(Plt;0.05)。

見表2。

3討論DNA甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

該機(jī)制的異化可導(dǎo)致基因表達(dá)的異常及基因組穩(wěn)定性的降低,繼而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

啟動(dòng)子CpG島的高甲基化已被認(rèn)為是與遺傳性缺陷同等重要的、造成抑癌基因在腫瘤中失活的分子生物學(xué)機(jī)制。

目前的研究認(rèn)為,大多數(shù)抑癌基因的失活是由于啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化所致[1]。

Dreijerink等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)通過5-Aza-CdR脫甲基處理，可激活RASSF1A的再表達(dá),并可抑制含有正常的VHL基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系在塑料盤和非貼璧的軟瓊脂上的生長。

本研究選用5-Aza-CdR作為去甲基化制劑處理膀胱癌細(xì)胞株，其為一種嘧啶類似物，在與復(fù)制過程中的DNA分子結(jié)合時(shí)該制劑可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ形成一共價(jià)復(fù)合物，抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，從而導(dǎo)致形成低甲基化的子鏈，實(shí)現(xiàn)去甲基化功能[3]。

研究結(jié)果表明5-Aza-CdR對(duì)EJ細(xì)胞的增殖有抑制作用，加入5-Aza-CdR后，與空白對(duì)照組相比，不同濃度5-Aza-CdR組EJ細(xì)胞增殖比差異顯著，且與5-Aza-CdR呈濃度依賴關(guān)系。

為了探討5-Aza-CdR的作用機(jī)制，我們應(yīng)用原位凋亡檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的EJ細(xì)胞凋亡，6且凋亡指數(shù)與5-Aza-CdR濃度呈明顯正相關(guān)。

5-Aza-CdR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為5-Aza-CdR可能是通過對(duì)RASSF1A基因的再表達(dá)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)行抑制[4]，活化的RAS癌蛋白在細(xì)胞中也許起到了雙重作用，通過效應(yīng)蛋白，一方面促進(jìn)細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化；另一方面它又促進(jìn)細(xì)胞的凋亡、衰老、壞死和終末分化。

而RASSF1基因可能就是編碼RAS后一種作用的特有的效應(yīng)蛋白，它的失活破壞了RAS的平衡作用，導(dǎo)致了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)換[5]。

也有學(xué)者認(rèn)為，5-Aza-CdR作用于腫瘤細(xì)胞使之產(chǎn)生凋亡可能是該類藥物的另一種作用機(jī)制，目前有關(guān)5-Aza-CdR對(duì)腫瘤的作用機(jī)制日益受到重視，但至今仍未確定其具體作用。

本研究發(fā)現(xiàn)EJ細(xì)胞培養(yǎng)24h后，用不同濃度的5-Aza-CdR作用EJ細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞明顯增加，與對(duì)照組相比差異有顯著性。

Tang等[6]在大腸癌的研究中也得到相同結(jié)論。

我們認(rèn)為5-Aza-CdR通過使RASSF1A、p16、p21等抑癌基因的再表達(dá)，通過對(duì)Rb家族的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的作用而誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯。

有研究中發(fā)現(xiàn)RASSF1A可以抑制CyclinD1的積聚而控制細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變[7]，因此5-Aza-CdR在細(xì)胞周期的G0/G1期調(diào)控細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展而對(duì)EJ細(xì)胞產(chǎn)生直接抑制作用。

5-Aza-CdR應(yīng)用于腫瘤治療已證實(shí)在復(fù)發(fā)性和頑固性急性白血病和慢性髓性白血病危象時(shí)具明顯療效[8]。

Gagnon等7[9]發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑在乳腺癌體外抗癌起協(xié)同作用，這種協(xié)同作用可提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，并可減少5-Aza-CdR的應(yīng)用劑量，減少大劑量帶來的毒副作用，同時(shí)加強(qiáng)抑制腫瘤的功能。

5-Aza-CdR誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡應(yīng)用于腫瘤治療，為進(jìn)一步研究膀胱腫瘤的治療提供了新的思路，值得進(jìn)一步深入研究。

【參考文獻(xiàn)】[1]PulukuriSM,RaoJS.Activationofp53/p21Waf1/Cip1pathwayby5-aza-2-deoxycytidineinhibitscellproliferation,inducespro-apoptoticgenesandmitogen-activatedproteinkinasesinhumanprostatecancercells[J].IntJOncol,2005,26(4):863-871.[2]DreijerinkK,BragaE,KuzminI,etal.Thecandidatetumorsuppressorgene,RASSF1A,fromhumanchromosome3p21.3isinvolvedinkidneytumorigenesis[J].ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(13):7504-7509.[3]ZhuWG,HilemanT,KeY,etal.5-aza-2-deoxycytidineactivatesthe8p53/p21Waf1/Cip1pathwaytoinhibitcellproliferation[J].JBiolChem,2004,279(15):15161-15166.[4]KuzminI,GillespieJW,ProtopopovA,etal.TheRASSF1Atumorsuppressorgeneisinactivatedinprostatetumorsandsuppressesgrowthofprostatecarcinomacells[J].CancerRes,2002,629(12):3498-3502.[5]VosMD,EllisCA,BellA,etal.RasusesthenoveltumorsuppressorRASSF1asaneffectortomediateapoptosis[J].JBiolChem,2000,275(46):35669-35672.[6]TangB,PengZH,YuPW,etal.Transcriptionregulationof5-Aza-2-deoxycytidineonmaspingenedemethylationinRKOhumancolorectalcellline[J].ZhonghuaWeiChangWaiKeZaZhi,2006,9(3):260-263.[7]ShivakumarL,MinnaJ,SakamaiT,etal.TheRASSF1Atumorsuppressorblockscellcyc