GB∕ T 40448-2021 麥角檢疫鑒定方法（正式版）

GB/T40448—2021國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40448—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。1GB/T40448—2021麥角檢疫鑒定方法本文件描述了麥角的檢疫鑒定方法。本文件適用于植物及其產(chǎn)品中麥角的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4麥角基本信息分類(lèi)地位：真菌界Fungi,子囊菌門(mén)Ascomycota,子囊菌亞門(mén)Ascomycotina,盤(pán)菌亞門(mén)Pezizomyco-tina,糞殼菌綱Sordariomycetes,肉座菌目Hypocreales,麥角菌科Clavicipitaceae,麥角菌屬Claviceps。無(wú)性世代屬無(wú)性菌類(lèi)Deuteromycetes,叢梗孢目Moniliales,瘤座孢科Tuberculariaceae,蜜孢霉屬麥角的其他信息參見(jiàn)附錄A。5方法原理PCR擴(kuò)增片段大小和測(cè)序結(jié)果等特征進(jìn)行結(jié)果判定。2EDTA,NaOH,KCl,CTAB,TBE,蛋白酶K,三氯甲烷，苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)溶液，3mol/L6.2.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯浸粉5.0g,葡萄糖20.7檢疫鑒定方法取樣品量1%～5%(若樣品少可適量增大比例)的植物及植物產(chǎn)品，用孔徑2.5mm～10.0mm的將麥角放入70%乙醇浸泡30s進(jìn)行表面消毒，移至1.3%的次氯酸鈉溶液中浸泡1.5min,再用無(wú)將三角瓶中菌絲轉(zhuǎn)到含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，22℃~25℃培養(yǎng)4d,用4mm的打孔器在菌落7.5.1DNA提取或CTAB方法提取麥角DNA(按照附錄C進(jìn)行操作)。引物1:ITS通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'/ITS4:5'-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3'引物2:β-微管蛋白基因通用引物Bt2a:5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'/Bt2b:5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'GB/T40448—202125μLPCR反應(yīng)體系中含有：10×PCR緩沖液(含25mmol/LMgCl?)2.5μL,2.5mmol/LdNTP0.5μL,20μmol/L正義引物和反義引物各1.0pL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL,50ng/μLDNAPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性3min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán)；7.5.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。將PCR產(chǎn)物送到公認(rèn)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，NCBI網(wǎng)站比對(duì)測(cè)序結(jié)果。8鑒定特征病菌形態(tài)特征圖參見(jiàn)附錄D。9結(jié)果判定a)如病菌與第8章描述的鑒定指標(biāo)相符，則可判定檢出麥角；b)如病菌與8.1描述的鑒定指標(biāo)相符，同時(shí)利用ITS通用引物ITS1與ITS4經(jīng)PCR擴(kuò)增得到樣品保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后方可處理。從檢測(cè)樣品中分離并鑒定為麥角的菌株，應(yīng)妥善保存。將菌株接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，20℃~25℃培養(yǎng)5d,然后4℃冰箱保存，或?qū)⒕z塊轉(zhuǎn)入20%滅菌甘油并混勻，-80℃長(zhǎng)期保存。對(duì)不需要34GB/T40448—2021長(zhǎng)期保存的菌株應(yīng)及時(shí)高壓滅菌處理。10.3結(jié)果記錄與資料保存和審核人員簽字。5GB/T40448—2021(資料性)A.1寄主范圍野麥(E.mollis)、匍匐冰草(E.repens)、老芒麥(E.sibiricus)、異源四倍體披堿草(E.trachycaulus)、羊茅屬(Festuca)、葦狀羊茅(F.arundicuroides)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、草地早熟禾(P.pratensis)、犬草(Roegneriasibiricus)、阿拉伯黃背草(Themedatriandra)、小麥屬(Triticum)、普通小麥(T.aestivum)、高粱屬A.2為害癥狀達(dá)40%～60%。A.4分布(國(guó)家和地區(qū))6GB/T40448—2021A.4.2非洲麥角菌(ClavicepsafricanaFrederickson,Mantle&deMilliano)的分布A.4.3百慕大草麥角(ClavicepscynodontisLangdon1954)的分布A.4.8Clavicepspallida(G.Winter)Henn.1899的分布A.4.9雀稗麥角(lavicepspaspaliStev.&Hall)的分布7GB/T40448—2021A.4.10蜀黍麥角菌(ClavicepssorghiKulkarniSeshadri&Hegde.)的分布A.5侵染循環(huán)麥角(即菌核)與作物同時(shí)成熟。當(dāng)作物收獲時(shí)，麥角掉落土中或混入種子中，病菌菌核在土壤中越冬，春季萌發(fā)出土，每個(gè)麥角萌發(fā)生出10個(gè)～20個(gè)子實(shí)體，子實(shí)體呈蘑菇狀，頭部膨大呈圓球形，稱子座，其直徑1mm～2mm,灰白色或紫紅色，下有一長(zhǎng)而彎曲的細(xì)柄。子座表層下埋生一層子囊殼，子囊殼瓶狀孔口稍突出于子座的表面，每個(gè)子囊殼內(nèi)產(chǎn)生數(shù)個(gè)長(zhǎng)圓筒形子囊，每個(gè)子囊內(nèi)產(chǎn)生8個(gè)線狀的單細(xì)胞的子囊孢子。到作物開(kāi)花時(shí)，子囊孢子借風(fēng)雨、昆蟲(chóng)傳播到寄主植物的花部，侵染小花。經(jīng)7d左右產(chǎn)生黃色蜜露狀黏液，約半月后形成菌核。菌核成熟后落入土中，越冬后成為第二年初侵染的主要來(lái)源。蜜露黏液內(nèi)有大量分生孢子，由昆蟲(chóng)將黏附在體上的孢子由病株帶到健株而傳播病害。此外，孢子還可借風(fēng)力和雨滴飛濺傳播或病穗直接碰撞擴(kuò)大傳播。種子中混雜的菌核也是侵染來(lái)源之一。作物開(kāi)花后20d,被侵染的子房就變成堅(jiān)硬的麥角。A.6流行規(guī)律寄主植物開(kāi)花期愈長(zhǎng)，作物的外穎張得愈大，受侵染的機(jī)會(huì)愈多。開(kāi)花期間潮濕多雨，有利于病菌的傳播和侵染。春季地面濕潤(rùn)，菌核易于萌發(fā)。菌核貯存一年以上便喪失生命力。菌核的孢子可由風(fēng)散布到很遠(yuǎn)的范圍。麥類(lèi)作物容易發(fā)生麥角病的次序是：黑麥>小黑麥>大麥>硬粒小麥>普通小麥>燕麥。8GB/T40448—2021(資料性)麥角檢疫鑒定流程圖麥角檢疫鑒定流程圖見(jiàn)圖B.1。癥狀檢查形態(tài)鑒定分子生物學(xué)鑒定NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，j預(yù)期月標(biāo)種序列最為接近符合病原菌形態(tài)特征檢山麥角檢出麥角麥角萌發(fā)圖B.1麥角檢疫鑒定流程圖9GB/T40448—2021(規(guī)范性)麥角DNA的提取方法C.1試劑盒提取麥角DNA的方法C.1.1將麥角樣品用液氮碾碎。C.1.2取40mg到1.5mLEP管，加600μL核酸裂解C.1.365℃水浴20min,溫和的混勻。C.1.714000r/min離心3min,取上清600μL。C.1.1014000r/min離心1min,棄上清(用槍吸干),放置于吸水紙上晾干(15min)。C.1.11加入100μLDNA重懸液，如果DNA很少，就加30μL,65℃溫育1h或4℃過(guò)夜。C.2CTAB法提取麥角DNA的方法C.2.1稱取經(jīng)液氮處理的疑似麥角物質(zhì)粉末0.1g,移到滅菌的2.0mL離心管中。離心管中加入300μL～500pμLCTAB緩沖液(其中含0.1g蛋白酶K)混勻，65℃水浴1h。三氯甲烷：異戊醇(24:1)混勻；13000g離心5min～10min,保留上清液；再加入500μL三氯甲烷：異戊醇(24:1)混勻；13000g離心5min～10min,保留上清液。C.2.3加入1mL異丙醇輕輕混勻，-70℃放置1h或-20℃過(guò)夜；13000g離心30min,可見(jiàn)DNA(資料性)禾草麥角菌Clavicepspurpurea(Fr.)Tul.1883為害癥狀以及病菌形態(tài)特征D.1禾草麥角菌Claviceps禾草麥角菌Clavicepspurpurea(Fr.)Tul.1883為害癥狀GB/T40448—2021圖D.3禾草麥角菌核及其萌發(fā)注2:引自https://www.pflanzenkrankheiten.ch/)。圖D.4禾草麥角菌形態(tài)特征D.2禾草麥角菌Clavicepspurpurea(Fr.)Tul.1883形態(tài)特征描述菌核細(xì)長(zhǎng)呈香蕉形，圓柱形，端部是圓形的，并且筆直至銳利彎曲。果皮堅(jiān)硬，紫黑色，有皺紋或有縱脊，菌核的內(nèi)部灰色到白色，(10mm～25mm)×3mm;子座柄細(xì)長(zhǎng)，頭部扁球形，直徑1mm~2mm,紅褐色，外緣生子囊殼；子囊殼全部埋于子座內(nèi)或稍外露，(200子囊細(xì)長(zhǎng)呈棍狀，(100μm～125pm)×4μm,先端壁厚，有中心孔，含8個(gè)絲狀的子囊狀子囊孢子；子囊GB/T40448—2021麥角蜜孢霉，在寄主子房?jī)?nèi)的菌絲墊中形成不規(guī)則的腔室，產(chǎn)生孢子；分生孢子卵形、單胞、無(wú)色，(4μm～6μm)×(2μm～3μm);它們混在黏液中溢出小穗外。菌核的大的大小而增加。黑麥的菌核可能比小麥的菌核更深裂。GB/T40448—2021[1]劉家熙.麥角菌[J].生物學(xué)通報(bào)，1997,32(4):17.[2]方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1998.[3]孫相輝，紀(jì)燕玲等.部分禾本科植物麥角病的發(fā)生及其病原真菌的特征[J].草業(yè)科學(xué)，2008.Vol.25,No.12:104-110.[5]SylviePazoutová,JanaOlsovská,MarekLinka,RenataKolínská,andMiroslavFlieger.Che-moracesandHabitatSpecializationofClavicepspurpureaPopulations.January2001;AppliedandEn-vironmentalMicrobiology66(12):5419-25.[6]M.Cerria,L.Realea,C.Morettia,R.Buonaurioa,etal.Clavicepsarundinisidentificationanditsroleinthedie-backsyndromeofPhragmitesaustralispopulationsincentralItaly.PlantBiosystems-AnInternationalJournalDealingwithallAspectsofPlantBiology,2017.[7]LionelN.Eleuterius&.SamuelP.Meyers.ClavicepsPurpureaonSpartinainCoastalMar-shes.Mycologia,2018,66(6):978-986.[8]AlisonJ.Fisher,J.M.DiTomaso,andT.R.Gordon.Conidialmorphologyandecologicalchar-acteristicsasdiagnostictoolsforidentifyingClavicepspurpureafromsalt-marshhabitats.CanadianJournalofPlantPathology.2005.27:389-395.[9]PazoutováS,etal.,DelimitationofcrypticspeciesinsideCla